Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita
Summary
Qui descriviamo il metodo del Set di repliche, un approccio misurare quantitativamente elegans del c. durata della vita/sopravvivenza e healthspan in un modo ad alta velocità e robusto, permettendo così lo screening di molte condizioni senza sacrificare la qualità dei dati. Questo protocollo dettagli la strategia e fornisce uno strumento software per l’analisi dei dati del Set di repliche.
Abstract
Il metodo del Set di repliche è un approccio per misurare quantitativamente la durata della vita o la sopravvivenza di Caenorhabditis elegans nematodi in un modo ad alta velocità, permettendo così un singolo investigatore per ulteriori trattamenti o condizioni schermo sopra la stessa quantità di tempo senza perdita di qualità dei dati. Il metodo richiede attrezzature comuni che si trovano nella maggior parte dei laboratori che lavorano con c. elegans , è così semplice da adottare. L’approccio incentrato su analizzando campioni indipendenti di una popolazione in ogni punto di osservazione, piuttosto che un singolo campione nel corso del tempo come con i metodi tradizionali longitudinali. Segnando comporta l’aggiunta di liquido nei pozzetti di una piastra multi-pozzetto, che stimola la c. elegans per spostare e facilita quantificare cambiamenti in healthspan. Altri vantaggi principali del metodo del Set di repliche includono ridotta esposizione delle superfici di agar da contaminanti trasportati dall’aria (ad es. muffe o funghi), minima manipolazione degli animali e robustezza al sporadici mis-gol (come chiamare un animale morto, quando è ancora vivo). Per adeguatamente analizzare e visualizzare i dati da un esperimento di stile del Set di repliche, uno strumento software personalizzato è stato anche sviluppato. Capacità attuale del software includono tracciare delle curve di sopravvivenza per sia del Set di repliche e tradizionale (Kaplan-Meier) esperimenti, nonché analisi statistiche per Set di repliche. I protocolli forniti qui descrivono il tradizionale approccio sperimentale e il metodo del Set di repliche, come pure una panoramica dell’analisi di dati corrispondente.
Introduction
Uno del maggior parte di trasformazione avanzamenti tecnologici verso la comprensione delle basi genetiche di invecchiamento è stato lo sviluppo di alimentazione-basata di RNAi nei elegans del c.1; prima l’uso sperimentale di RNAi, molti fenotipi di invecchiamento non erano geneticamente trattabili. Alimentazione-basata RNAi è raggiunto attraverso la produzione di dsRNA all’interno di e. coli che corrisponde a un endogeno mRNA di c. elegans : IPTG induce la trascrizione di bidirezionale attraverso un inserto di cDNA di c. elegans sia o una porzione di un telaio di lettura aperto all’interno di un plasmide2. Quando c. elegans nutrirsi intatto dsRNA di e. coli, prodotta dai batteri è trasportato dal lume intestinale cellule tramite la proteina transmembrana di SID-23e poi distribuito attraverso il resto dell’animale tramite SID-14. All’interno di ogni cella, dsRNA esogeno viene elaborato dalla cubettatrice complessa in siRNA, che interagiscono con un mRNA maturo tramite appaiamento complementare per creare un nuovo duplex siRNA-mRNA. Questo duplex è riconosciuto dal complesso RISC e spaccato, quindi degradare l’ mRNA endogena5. Così, semplicemente cambiando l’inserto di plasmide, uno può inattivare la funzione di quasi qualsiasi gene all’interno del genoma di c. elegans . Questa scoperta ha portata alla creazione di più grande alimentazione-basata RNAi trasformato librerie-collezioni di stock di e. coli che possono essere combinati per ottenere una copertura di circa l’86% del noto di c. elegans geni6, 7.
Dall’avanzamento della RNAi basate su alimentazione, schermi completi in c. elegans hanno portato alla scoperta di più di 900 geni che alterano la durata quando inattivato (come testimoniano le associazioni di RNAi-fenotipo curate in WormBase), cui ci riferiamo a come gerogenes. Un ruolo per la maggior parte dei gerogenes nel controllo di longevità è stata scoperta attraverso alimentazione-basata di RNAi nei pochi rapporti seminale (Vedi Figura 1A e 1 File supplementare per i dettagli). In alcuni casi, questi gerogenes sono stati identificati basato su misura la redditività in un singolo o pochi punti di tempo, che non riesce a fornire una misura quantificabile del cambiamento nella durata della vita con trattamento RNAi. In altri casi, questi geni sono stati valutati quantitativamente per cambiamenti nella durata della vita, come pure altri fenotipi età-collegato. Per esempio, precedentemente abbiamo identificato 159 geni che erano necessarie per normale e una maggiore durata della vita degli animali con la segnalazione dell’insulina/IGF-1 in diminuzione e quantificate le modifiche in healthspan. Di questi, 103 inattivazioni gene comportano un fenotipo progeric, di perdita è provocato da uno o più segni di invecchiamento precoce8.
Mentre alcuni gerogenes sono stati associati con 100 o più studi (ad es. daf-16, daf-2, sir-2.1), oltre 400 gerogenes hanno citazioni 10 o meno (Figura 1Be supplementare File 2). Così, mentre completa basata su alimentazione RNAi schermi hanno scoperto e superficialmente caratterizzato centinaia di presunti gerogenes, come questi geni in funzione nel controllo di longevità e le correlazioni genetiche tra questi prodotti genici rimangono scarsamente ha studiato. Analisi completa longitudinale per età-collegata di fenotipi è un prerequisito per l’identificazione di interazioni genetiche tra gerogenes (ad es. interazioni epistatiche, interazioni asintetiche, ecc.). Guadagnando più approfondite le correlazioni genetiche tra gerogenes richiede un metodo quantitativo di alto-rendimento, che sfrutta anche i vantaggi dell’alimentazione basato su RNAi.
La più comune misura di surrogato di invecchiamento è durata della vita. L’approccio tradizionale per misurare la mortalità di c. elegans traccia le morti degli animali individuali nel tempo all’interno di un campione di popolazione piccola. Un numero relativamente piccolo di animali è seguito nel tempo e periodicamente è spronato delicatamente con un filo di platino o ciglia, con movimento come un indicatore della redditività (Figura 2A). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato, in quanto fornisce misurazioni semplici, diretti della media e la massima durata. Tuttavia, questo metodo tradizionale è che richiede tempo e relativamente basso-velocità di trasmissione, che limita il numero di animali e condizioni che possono essere misurate simultaneamente in modo controllato. Un recente studio di simulazione trovato che molti studi di durata della vita di c. elegans non analisi di un numero sufficiente di animali per essere in grado di rilevare in modo affidabile piccole modifiche tra circostanze9. Inoltre, questo metodo tradizionale comporta la manipolazione ripetutamente la stessa coorte degli animali nel corso del tempo, che a sua volta può introdurre contaminazione e possono danneggiare o uccidere animali sempre più fragili, invecchiati.
Abbiamo sviluppato una metodologia alternativa “Replica Set” per misurare la durata della vita di c. elegans . A tal fine, una grande popolazione di età-sincronizzato, isogeniche animali sono divisi in una serie di piccole popolazioni (o repliche). Numero sufficiente di campioni replica vengono generati per coprire ogni punto del tempo nell’esperimento pianificato. In ogni punto del tempo di osservazione, una delle repliche è segnata per il numero di morti viventi e animali censurati, poi gli animali all’interno di replicati vengono scartati. Così, oltre la durata prevista della popolazione nel suo complesso, una serie di sottopopolazioni indipendenti sono periodicamente campionate (Figura 2B). Utilizzando il set di repliche non c’è nessun incitamento ripetute degli animali e senza l’esposizione ripetuta a potenziale contaminazione ambientale. L’attuabilità osservato al punto una tantum è completamente indipendente da ogni altra osservazione, che riduce al minimo la gestione e aumenta la velocità effettiva di almeno un ordine di grandezza. Questo ci ha permesso di quantificare i cambiamenti nella durata della vita per centinaia di RNAi cloni contemporaneamente8,10.
Qui presentiamo protocolli dettagliati per lo svolgimento di durata della vita di c. elegans via del Set di repliche e metodi tradizionali per la segnatura di c. elegans longevità. Dimostriamo che si ottengono risultati simili tra i metodi. Abbiamo sviluppato software per facilitare l’analisi grafica dei dati di durata della vita generati attraverso entrambi gli approcci, che forniamo liberamente sotto una licenza GPL V3 (Vedi tabella materiali). “WormLife” è scritto in R11e include un’interfaccia utente grafica (GUI) per la rappresentazione dei dati, che sono stati testati in Mac OS e Linux. Infine, confrontiamo e le limitazioni di ciascun metodo di contrasto ed evidenziare altre considerazioni quando si sceglie tra gli approcci per misurare variazioni quantitative nella durata della vita di c. elegans .
Protocol
Representative Results
Discussion
Entrambi i metodi tradizionali e replica set richiedono la sincronizzazione degli animali invecchiati in ordine cronologico. Includiamo un metodo che consente di sincronizzare gli animali utilizzando trattamento ipoclorito di gravid adulti, dove solo le uova fecondate con l’adulto gravid sopravvivono al trattamento. Questi embrioni schiudono in sospensione liquida e arrestano inerente allo sviluppo nella prima fase larvale (L1). Dopo la semina L1 animali sul cibo (ad esempio e. coli che esprimono dsRNA …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamenti per questo lavoro descritto in questo manoscritto è stato fornito da: l’ufficio università di Rochester di The Provost e la scuola di medicina e odontoiatria decanato di tramite il centro di Scienze di salute per l’innovazione computazionale (HSCCI); Ellison Medical Foundation nuovi studiosi in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) i finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genética. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genética. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
