Metoden sett replika: En høy gjennomstrømming tilnærming til kvantitativt mål Caenorhabditis elegans levetid
Summary
Her beskriver vi metoden replika, en tilnærming til kvantitativt mål C. elegans levetid/overlevelse og healthspan på en høy gjennomstrømming og robust måte, slik at screening av mange forhold uten å ofre kvalitet. Denne protokollen detaljer strategien og gir et verktøy for analyse av replikasettet data.
Abstract
Metoden replikasettet er en kvantitativt måle levetid eller overlevelse av Caenorhabditis elegans nematoder på en høy gjennomstrømming måte, slik at en enkelt etterforsker til skjermen mer behandlinger eller forhold over samme mengde tid uten tap av kvalitet. Metoden krever felles utstyr finnes i de fleste laboratorier arbeider med C. elegans og er dermed enkelt å adoptere. Tilnærmingen sentre på assaying uavhengige utvalg fra en populasjon på hvert observasjon poeng, i stedet for et enkelt utvalg over tid som med tradisjonelle langsgående metoder. Scoring innebærer legger væske fordelt av en flere godt plate, som stimulerer C. elegans flytte og forenkler kvantifisere endringer i healthspan. Andre store fordeler av metoden replikasett inkluderer redusert eksponering av agar overflater til luftbåren forurensning (f.eks mold eller sopp), minimal håndtering av dyr og robusthet til sporadiske mis scoring (for eksempel ringer et dyr som døde da det er fortsatt i live). Å riktig analysere og visualisere data fra et replikasett stil eksperiment, utviklet også en tilpasset Programvareverktøyet. Gjeldende funksjoner i programvaren inkluderer plotting av overlevelse kurver for både replikasettet og tradisjonelle (Kaplan-Meier) eksperimenter, som statistisk analyse for replikasettet. Protokollene her beskriver den tradisjonelle tilnærmingen for eksperimentell og metoden replikasett, samt en oversikt over tilsvarende dataanalyse.
Introduction
En av de mest transformerende teknologiske fremskritt mot å forstå genetisk grunnlag av aldring var utviklingen av fôring-baserte RNAi i C. elegans1; før eksperimentell bruk av RNAi var mange fenotyper av aldring ikke genetisk medgjørlig. Fôring-baserte RNAi oppnås gjennom produksjon av dsRNA i E. coli som samsvarer med en endogene C. elegans mRNA: IPTG induserer toveis transkripsjon over en sette av enten C. elegans cDNA eller en del av en Åpne lesing ramme innenfor en plasmider2. Når C. elegans overmodne intakt er E. coli, dsRNA produsert av bakterier transportert fra lumen inn intestinal celler via SID-2 transmembrane protein3, og deretter distribuert gjennom resten av dyret via SID-14. I hver celle eksogene dsRNA behandles av Dicer kompleks i siRNA, som samhandler med en eldre mRNA via utfyllende base sammenkobling å opprette en ny siRNA-mRNA dupleks. Denne dupleks er anerkjent av RISC komplekset og kløyvde, dermed nedverdigende endogene mRNA5. Dermed bare endrer plasmider innsatsen, kan en deaktivere funksjonen av nesten alle genet i C. elegans genomet. Funnet ledet til etableringen av flere store fôring-baserte RNAi biblioteker-samlinger av forvandlet E. coli aksjer som kan kombineres for å oppnå dekning av ca 86% av kjent C. elegans gener6, 7.
Siden fremme av fôring-baserte RNAi, har omfattende skjermer i C. elegans ført til oppdagelsen av mer enn 900 gener som endrer levetid når inaktiv (som dokumentert av RNAi-fenotypen foreninger kuratert i WormBase), som vi kaller til som gerogenes. En rolle for flertallet av gerogenes levetid kontroll ble oppdaget gjennom fôring-baserte RNAi i noen banebrytende rapporter (se figur 1A og supplerende fil 1 for detaljer). I noen tilfeller har disse gerogenes identifisert basert på måling levedyktighet på én eller noen få tidspunkt, som ikke klarer å gi en målbare mål på endring i levetid RNAi behandling. I andre tilfeller har disse genene kvantitativt vurdert for endringer i levetid, samt ekstra alder-assosiert fenotyper. For eksempel identifisert vi tidligere 159 gener som var nødvendig for både vanlig og økt levetid på dyr med redusert insulin/IGF-1 signalering, og kvantifisert endringer i healthspan. Av disse resultere 103 genet inactivations i en progeric fenotype, som tap resulterte i ett eller flere tegn til tidlig aldring8.
Mens noen gerogenes har blitt assosiert med 100 eller flere studier (f.eks daf-16, daf-2, sir-2.1), har over 400 gerogenes 10 eller færre sitater (figur 1Bog supplerende fil 2). Dermed mens omfattende fôring-baserte RNAi skjermer har oppdaget og cursorily preget hundrevis av antatte gerogenes, hvordan disse genene funksjonen levetid kontroll og til genetisk innbyrdes forbindelser mellom produktene genet fortsatt dårlig studerte. Full langsgående analyse for alder-assosiert fenotyper er en forutsetning for å identifisere genetiske interaksjoner mellom gerogenes (f.eks epistatic vekselsvirkningene, asynthetic vekselsvirkningene, etc.). Få dypere innsikt i de genetiske sammenhengen mellom gerogenes krever en høy gjennomstrømming kvantitativ metode, som også benytter fordelene med fôring-baserte RNAi.
Det vanligste surrogat målet aldring er levetid. Den tradisjonelle tilnærmingen for å måle C. elegans dødelighet spor dødsfall av enkelte dyr over tid i en liten populasjon. Et relativt lite antall dyr følges over tid og med jevne mellomrom er forsiktig prodded en platina wire eller øyenvippe, med bevegelse som en indikator av levedyktighet (figur 2A). Denne metoden har vært mye brukt, som det gir enkel, direkte målinger av gjennomsnittlig og maksimal levetid. Men er denne tradisjonelle metoden tidkrevende og relativt lav-gjennomstrømning, som begrenser antall dyr og forhold som samtidig kan måles på en kontrollert måte. En fersk simulering studie fant at mange C. elegans levetid studier ikke analysen nok mange dyrene kunne oppdage små endringer mellom forhold9. Videre innebærer denne tradisjonelle metoden håndtering gjentatte ganger samme kohort av dyr over tid, som i sin tur kan introdusere forurensning, og kan skade eller drepe stadig skjøre, alderen dyr.
Vi har utviklet en alternativ “replikasett” metode for å måle C. elegans levetid. Dette er en stor bestand av alder-synkronisert, isogenic dyr inndelt i en rekke små bestander (eller kopier). Nok kopi prøver genereres for å dekke hvert punkt i planlagte eksperimentet. Hver observasjon tidspunkt, en av replikaene er scoret av levende, døde og sensurert dyr og dyr i at gjenskape er forkastet. Dermed over forventet levetid av befolkningen som helhet, en rekke uavhengige subpopulasjoner er regelmessig samplet (figur 2B). I bruker replikasett er det ingen gjentatte prodding og ingen gjentatt eksponering for potensielle miljøforurensning. Levedyktigheten observert på engangsreferansenummer punkt er helt uavhengig av alle andre observasjon, som minimerer håndtering og øker gjennomstrømningen av minst en størrelsesorden. Dette har tillatt oss å quantitate endringer i levetid for hundrevis av RNAi kloner samtidig8,10.
Her presenterer vi detaljerte protokoller for å gjennomføre C. elegans levetid via både replikasettet og tradisjonelle metoder for scoring C. elegans levetid. Vi viser at lignende resultater oppnås mellom metodene. Vi har utviklet programvare for å bistå i den grafiske analysen levetid data generert gjennom enten tilnærming, som tilbyr fritt under GPL V3 lisens (se tabell over materialer). “WormLife” er skrevet i R11, og inkluderer et grafisk brukergrensesnitt (GUI) for plotting data som har blitt testet i Mac OS og Linux. Til slutt, vi sammenligne og kontrast begrensningene for hver metode og markere andre hensyn når du velger mellom tilnærminger til å måle kvantitative endringer i C. elegans levetid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både tradisjonelle og kopi angi metodene krever synkronisering av kronologisk alderen dyr. Vi inkluderer en metode som synkroniserer dyr med hypokloritt behandling av gravid voksne, hvor bare befruktede egg med gravid voksen overleve behandling. Disse Foster klekkes i flytende suspensjon og developmentally arrestere på første larvestadiet (L1). Etter seeding L1 dyr til mat (f.eks E. coli uttrykke dsRNA til en genet av interesse), gjenoppta dyr utvikling. Synkronisere L1 dyr av hypokloritt behandling …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler til dette arbeidet som beskrevet i dette manuskriptet ble levert av: Universitetet i Rochester Office of The Provost og School of Medicine og Dentistry Dekanus kontor via Health Sciences Center for beregningsorientert innovasjon (HSCCI); Ellison medisinsk Foundation nye forskere i aldring fellesskap (AG-NS-0681-10) vil Oppdragsgivers ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genética. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genética. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
