Her beskriver vi metoden replika, en tilnærming til kvantitativt mål C. elegans levetid/overlevelse og healthspan på en høy gjennomstrømming og robust måte, slik at screening av mange forhold uten å ofre kvalitet. Denne protokollen detaljer strategien og gir et verktøy for analyse av replikasettet data.
Metoden replikasettet er en kvantitativt måle levetid eller overlevelse av Caenorhabditis elegans nematoder på en høy gjennomstrømming måte, slik at en enkelt etterforsker til skjermen mer behandlinger eller forhold over samme mengde tid uten tap av kvalitet. Metoden krever felles utstyr finnes i de fleste laboratorier arbeider med C. elegans og er dermed enkelt å adoptere. Tilnærmingen sentre på assaying uavhengige utvalg fra en populasjon på hvert observasjon poeng, i stedet for et enkelt utvalg over tid som med tradisjonelle langsgående metoder. Scoring innebærer legger væske fordelt av en flere godt plate, som stimulerer C. elegans flytte og forenkler kvantifisere endringer i healthspan. Andre store fordeler av metoden replikasett inkluderer redusert eksponering av agar overflater til luftbåren forurensning (f.eks mold eller sopp), minimal håndtering av dyr og robusthet til sporadiske mis scoring (for eksempel ringer et dyr som døde da det er fortsatt i live). Å riktig analysere og visualisere data fra et replikasett stil eksperiment, utviklet også en tilpasset Programvareverktøyet. Gjeldende funksjoner i programvaren inkluderer plotting av overlevelse kurver for både replikasettet og tradisjonelle (Kaplan-Meier) eksperimenter, som statistisk analyse for replikasettet. Protokollene her beskriver den tradisjonelle tilnærmingen for eksperimentell og metoden replikasett, samt en oversikt over tilsvarende dataanalyse.
En av de mest transformerende teknologiske fremskritt mot å forstå genetisk grunnlag av aldring var utviklingen av fôring-baserte RNAi i C. elegans1; før eksperimentell bruk av RNAi var mange fenotyper av aldring ikke genetisk medgjørlig. Fôring-baserte RNAi oppnås gjennom produksjon av dsRNA i E. coli som samsvarer med en endogene C. elegans mRNA: IPTG induserer toveis transkripsjon over en sette av enten C. elegans cDNA eller en del av en Åpne lesing ramme innenfor en plasmider2. Når C. elegans overmodne intakt er E. coli, dsRNA produsert av bakterier transportert fra lumen inn intestinal celler via SID-2 transmembrane protein3, og deretter distribuert gjennom resten av dyret via SID-14. I hver celle eksogene dsRNA behandles av Dicer kompleks i siRNA, som samhandler med en eldre mRNA via utfyllende base sammenkobling å opprette en ny siRNA-mRNA dupleks. Denne dupleks er anerkjent av RISC komplekset og kløyvde, dermed nedverdigende endogene mRNA5. Dermed bare endrer plasmider innsatsen, kan en deaktivere funksjonen av nesten alle genet i C. elegans genomet. Funnet ledet til etableringen av flere store fôring-baserte RNAi biblioteker-samlinger av forvandlet E. coli aksjer som kan kombineres for å oppnå dekning av ca 86% av kjent C. elegans gener6, 7.
Siden fremme av fôring-baserte RNAi, har omfattende skjermer i C. elegans ført til oppdagelsen av mer enn 900 gener som endrer levetid når inaktiv (som dokumentert av RNAi-fenotypen foreninger kuratert i WormBase), som vi kaller til som gerogenes. En rolle for flertallet av gerogenes levetid kontroll ble oppdaget gjennom fôring-baserte RNAi i noen banebrytende rapporter (se figur 1A og supplerende fil 1 for detaljer). I noen tilfeller har disse gerogenes identifisert basert på måling levedyktighet på én eller noen få tidspunkt, som ikke klarer å gi en målbare mål på endring i levetid RNAi behandling. I andre tilfeller har disse genene kvantitativt vurdert for endringer i levetid, samt ekstra alder-assosiert fenotyper. For eksempel identifisert vi tidligere 159 gener som var nødvendig for både vanlig og økt levetid på dyr med redusert insulin/IGF-1 signalering, og kvantifisert endringer i healthspan. Av disse resultere 103 genet inactivations i en progeric fenotype, som tap resulterte i ett eller flere tegn til tidlig aldring8.
Mens noen gerogenes har blitt assosiert med 100 eller flere studier (f.eks daf-16, daf-2, sir-2.1), har over 400 gerogenes 10 eller færre sitater (figur 1Bog supplerende fil 2). Dermed mens omfattende fôring-baserte RNAi skjermer har oppdaget og cursorily preget hundrevis av antatte gerogenes, hvordan disse genene funksjonen levetid kontroll og til genetisk innbyrdes forbindelser mellom produktene genet fortsatt dårlig studerte. Full langsgående analyse for alder-assosiert fenotyper er en forutsetning for å identifisere genetiske interaksjoner mellom gerogenes (f.eks epistatic vekselsvirkningene, asynthetic vekselsvirkningene, etc.). Få dypere innsikt i de genetiske sammenhengen mellom gerogenes krever en høy gjennomstrømming kvantitativ metode, som også benytter fordelene med fôring-baserte RNAi.
Det vanligste surrogat målet aldring er levetid. Den tradisjonelle tilnærmingen for å måle C. elegans dødelighet spor dødsfall av enkelte dyr over tid i en liten populasjon. Et relativt lite antall dyr følges over tid og med jevne mellomrom er forsiktig prodded en platina wire eller øyenvippe, med bevegelse som en indikator av levedyktighet (figur 2A). Denne metoden har vært mye brukt, som det gir enkel, direkte målinger av gjennomsnittlig og maksimal levetid. Men er denne tradisjonelle metoden tidkrevende og relativt lav-gjennomstrømning, som begrenser antall dyr og forhold som samtidig kan måles på en kontrollert måte. En fersk simulering studie fant at mange C. elegans levetid studier ikke analysen nok mange dyrene kunne oppdage små endringer mellom forhold9. Videre innebærer denne tradisjonelle metoden håndtering gjentatte ganger samme kohort av dyr over tid, som i sin tur kan introdusere forurensning, og kan skade eller drepe stadig skjøre, alderen dyr.
Vi har utviklet en alternativ “replikasett” metode for å måle C. elegans levetid. Dette er en stor bestand av alder-synkronisert, isogenic dyr inndelt i en rekke små bestander (eller kopier). Nok kopi prøver genereres for å dekke hvert punkt i planlagte eksperimentet. Hver observasjon tidspunkt, en av replikaene er scoret av levende, døde og sensurert dyr og dyr i at gjenskape er forkastet. Dermed over forventet levetid av befolkningen som helhet, en rekke uavhengige subpopulasjoner er regelmessig samplet (figur 2B). I bruker replikasett er det ingen gjentatte prodding og ingen gjentatt eksponering for potensielle miljøforurensning. Levedyktigheten observert på engangsreferansenummer punkt er helt uavhengig av alle andre observasjon, som minimerer håndtering og øker gjennomstrømningen av minst en størrelsesorden. Dette har tillatt oss å quantitate endringer i levetid for hundrevis av RNAi kloner samtidig8,10.
Her presenterer vi detaljerte protokoller for å gjennomføre C. elegans levetid via både replikasettet og tradisjonelle metoder for scoring C. elegans levetid. Vi viser at lignende resultater oppnås mellom metodene. Vi har utviklet programvare for å bistå i den grafiske analysen levetid data generert gjennom enten tilnærming, som tilbyr fritt under GPL V3 lisens (se tabell over materialer). “WormLife” er skrevet i R11, og inkluderer et grafisk brukergrensesnitt (GUI) for plotting data som har blitt testet i Mac OS og Linux. Til slutt, vi sammenligne og kontrast begrensningene for hver metode og markere andre hensyn når du velger mellom tilnærminger til å måle kvantitative endringer i C. elegans levetid.
Både tradisjonelle og kopi angi metodene krever synkronisering av kronologisk alderen dyr. Vi inkluderer en metode som synkroniserer dyr med hypokloritt behandling av gravid voksne, hvor bare befruktede egg med gravid voksen overleve behandling. Disse Foster klekkes i flytende suspensjon og developmentally arrestere på første larvestadiet (L1). Etter seeding L1 dyr til mat (f.eks E. coli uttrykke dsRNA til en genet av interesse), gjenoppta dyr utvikling. Synkronisere L1 dyr av hypokloritt behandling …
The authors have nothing to disclose.
Midler til dette arbeidet som beskrevet i dette manuskriptet ble levert av: Universitetet i Rochester Office of The Provost og School of Medicine og Dentistry Dekanus kontor via Health Sciences Center for beregningsorientert innovasjon (HSCCI); Ellison medisinsk Foundation nye forskere i aldring fellesskap (AG-NS-0681-10) vil Oppdragsgivers ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |