Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü
Summary
Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.
Abstract
Yineleme kümesi yöntemi kantitatif ömrü veya Caenorhabditis elegans nematodlar yaşama böylece ekran üzerinde aynı miktarda daha fazla tedaviler veya koşullar için tek bir dedektif sağlayan bir yüksek-den geçerek şekilde ölçmek için bir yaklaşımdır zaman veri kalite kaybı olmadan. Yöntem ortak ekipman C. elegans ile çalışan çoğu laboratuarlarında bulundu gerektirir ve böylece benimsemeye basittir. Yaklaşım, her bir gözlem noktada bir nüfusun bağımsız örnekleri yerine tek bir örnek zaman içinde geleneksel boyuna yöntemleriyle raporlaması merkezleri. Çok iyi bir tabak wells için sıvı ekleyerek gerektirdiği Puanlama, hangi taşımak için C. elegans uyarır ve sayısal healthspan değişimler kolaylaştırır. Yineleme kümesi yöntemi diğer önemli faydaları azaltılmış teshir edilmesi hava kirleticileri (Örneğin kalıp veya mantar), agar yüzeylere dahil en az hayvan ve sağlamlık sporadik (hala olduğunda bir hayvan ölü arama gibi yanlış Puanlama için işleme hayatta). Uygun şekilde çözümlemek ve bir yineleme kümesi stili deney verileri görselleştirmek için özel yazılım aracı da geliştirilmiştir. Geçerli yazılım yineleme kümesi için her iki yineleme kümesi ve geleneksel (Kaplan-Meier) deneyler yanı sıra için istatistiksel analiz hayatta kalma eğrileri komplo becerisi. Burada sağlanan protokoller karşılık gelen veri analizi genel bakış yanı sıra geleneksel deneysel yaklaşım ve yineleme kümesi yöntemi açıklanmaktadır.
Introduction
Bir yaşlanma genetik temeli anlama doğru en dönüştürücü teknolojik gelişmeler besleme tabanlı RNAi C. elegans1belirlendi; RNAi deneysel kullanılmadan önce birçok fenotipleri yaşlanma genetik olarak uysal değildi. Besleme tabanlı RNAi dsRNA E. coli eşleşen içinde üretim ile elde bir endojen C. elegans mRNA: IPTG ya C. elegans cDNA bir ekleme veya bir kısmı arasında çift yönlü transkripsiyon indükler bir Açık okuma çerçevesi içinde bir plazmid2. C. elegans üzerine sağlam beslerken bakteriler tarafından üretilen E. coli, dsRNA SID-2 transmembran protein3üzerinden bağırsak hücreleri içine lümen taşınan ve hayvan SID-14üzerinden kalan dağıtılmış. Her hücre içinde eksojen dsRNA karmaşık Dicer tarafından siRNA, hangi yeni bir oluşturmak için tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla bir olgun mRNA ile etkileşim işlenir siRNA-mRNA dubleks. Bu çift yönlü RISC kompleksi tarafından tanınan ve böylece i ciddi endojen mRNA5aşağılayıcı. Böylece, sadece plazmid Ekle değiştirilirse tarafından bir C. elegans genom içinde neredeyse herhangi bir gen işlevini devre dışı. Kütüphaneler-koleksiyonları kapsamında yaklaşık %86 ulaşmak için bir araya getirilebilen E. coli stokları dönüştürülmüş birkaç büyük besleme tabanlı RNAi yol açtı bu keşif C. elegans genler6, bilinen 7.
Besleme tabanlı RNAi ilerlemesi beri biz bakın (WormBase içinde küratörlüğünü RNAi fenotip dernekler tarafından kanıtlanan) inaktive zaman ömrü alter 900’den fazla gen keşfi için kapsamlı filtrelerinde de C. elegans açmıştır için gerogenes olarak. Bir rol gerogenes uzun ömürlü denetimindeki çoğunluğu için besleme tabanlı RNAi sadece birkaç seminal raporları ile keşfedilmiştir ( Şekil 1A ve ek dosya 1 Ayrıntılar için bakınız). Bazı durumlarda, bu gerogenes ömrü içinde değişimin ölçülebilir bir ölçü RNAi tedavi ile sağlamak için başarısız canlılığı tek bir veya birkaç zaman puan, ölçme üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Diğer durumlarda, bu genlerin kantitatif değişikliklerin ömrü yanı sıra ek yaş ilişkili fenotipleri değerlendirildi. Örneğin, daha önce azalmış insülin/IGF-1 sinyal ile hayvanların normal ve artan ömrü için gerekliydi ve healthspan değişiklikleri sayılabilir 159 genlerin tanımlanmış. Bir veya daha fazla erken yaşlanma8ayetlerine neden olarak bu progeric bir fenotip içinde 103 gen inactivations kaynaklanır.
Bazı gerogenes 100 veya daha fazla çalışmaları ile (Örneğin daf-16, daf-2, efendim-2.1) ilişkili olan, 400’den fazla gerogenes 10 veya daha az alıntılar (Şekil 1Bve ek dosya 2) vardır. Kapsamlı besleme tabanlı RNAi ekranların vardır keşfetti ve cursorily sözde gerogenes yüzlerce ile karakterize, böylece, nasıl uzun ömürlü denetimindeki Bu genler işlevi ve bu gen ürünleri arasında genetik karşılıklı ilişkileri kötü kalır okudu. Tam boyuna analiz için yaş ilişkili fenotipleri gerogenes (Örneğin epistatic etkileşimleri, asynthetic etkileşimleri, vb) arasındaki genetik etkileşimler tanımlamak için bir önkoşuldur. Gerogenes arasında genetik karşılıklı ilişkileri daha derin bir anlayış kazanıyor Ayrıca besleme tabanlı RNAi avantajları güçlendirir bir yüksek-den geçerek nicel yöntemi gerektirir.
En yaygın vekil yaşlanma ömrü ölçüsüdür. C. elegans mortalite ölçmek için geleneksel yaklaşım bireysel hayvan ölümleri küçük grup örneğinin içinde zamanla izler. Hayvanlar nispeten az sayıda zaman içinde takip edilmektedir ve düzenli aralıklarla yavaşça bir platin tel veya kirpik, canlılık (Şekil 2A) bir göstergesi olarak hareketi ile prodded. Ortalama ve maksimum ömrü basit, doğrudan ölçümleri sağladığından bu yöntemi yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu geleneksel hangi hayvanlar ve aynı anda denetimli bir biçimde ölçülebilir koşulları sayısını sınırlar zaman alıcı ve nispeten düşük verimlilik, bir yöntemdir. Son bir simülasyon çalışması birçok C. elegans ömrü çalışmalar hayvanlar güvenilir koşullar9arasında küçük değişiklikler tespit edebilmek için yeterince büyük bir dizi tahlil değil bulundu. Ayrıca, bu geleneksel Yöntem art arda hayvanların aynı kohort hangi sırayla kirlenme, tanıtmak ve zarar verebilir veya giderek kırılgan, yaşlı hayvan öldürmek zaman içinde işleme içerir.
C. elegans ömrü ölçmek için bir alternatif “kopya kümesi” yöntem geliştirdik. Bu amaçla, Yaş senkronize, isogenic hayvanların büyük bir nüfus küçük nüfus (veya yinelemeler) bir dizi halinde ayrılır. Yeterli yineleme örnekleri her zaman noktası planlı deneyinde kapsayacak şekilde oluşturulur. Her gözlem zamanda noktada yinelemelerden herhangi birini yaşayan ölü sayısı için attı ve sansürlü hayvanlar, sonra hayvanlar bu çoğaltma içinde atılır. Böylece, beklenen yaşam süresi bir bütün olarak bir dizi bağımsız altgrupları nüfusunun çoğu düzenli olarak bitti (Şekil 2B) örneklenmiş. Çoğaltma kümeleri kullanarak işte hiçbir yinelenen dürtmeye hayvan ve potansiyel çevresel kirlenme yok tekrarlanan maruz kalma. Tek seferlik noktada gözlenen canlılık işleme en aza indirir ve en az bir büyüklük tarafından üretilen iş artırır her diğer gözlem, tamamen bağımsızdır. Bu bize RNAi yüzlerce aynı anda8,10klonlar için değişiklikleri ömrü içinde quantitate izin verdi.
C. elegans ömrü yineleme kümesi ve C. elegans uzun ömürlü Puanlama için geleneksel yöntemler üzerinden yürütmek için detaylı protokolleri mevcut burada. Benzer sonuçlar yöntemleri arasında elde edilen göstermektedir. Biz özgürce bir GPL V3 lisansı (bkz: tablo malzemelerin) sağlamak ya da bir yaklaşımla oluşturulan ömrü verilerin grafik çözümlemesini yardımcı olmak üzere geliştirilen yazılım var. “WormLife” R11‘ de yazılan ve Mac OS ve Linux test verileri çizmek için bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içerir. Son olarak, biz karşılaştırmak ve her yöntemi sınırlamaları kontrast ve C. elegans ömrü içinde nicel değişiklikleri ölçmek için yaklaşımlar arasında seçim yaparken dikkat edilmesi gereken diğer noktalar vurgulayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her iki geleneksel ve yineleme kümesi yöntemleri kronolojik olarak yaşlı hayvanlar eşitlenmesi gerekir. Biz hayvanlar nerede sadece döllenmiş yumurta gravid yetişkin ile tedavi hayatta hipoklorit tedavi gravid yetişkinlerin kullanarak eşitler bir yöntem içerir. Bu embriyo sıvı süspansiyon yumurtadan ve gelişimsel olarak ilk larva aşamasında (L1) tutukla. L1 hayvanlar yiyecek (Örneğin E. coli ifade dsRNA bir gen ilgi için) üzerine tohum sonra hayvanlar geliştirme devam. L1 hayvanla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu el yazması açıklanan bu eser tarafından sağlanan için finansman: Rochester Üniversitesi Office Provost ve Tıp Fakültesi ve diş hekimliği Dekanlık yolu ile Sağlık Bilimleri merkez için Hesaplamalı yenilik (HSCCI); Ellison tıbbi Vakfı yeni akademisyenler yaşlanma Bursu (AG-NS-0681-10) fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genética. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genética. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
