Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

Resumo

Um dispositivo de microscopia in situ foto-óptico foi desenvolvido para monitorar o tamanho de células individuais diretamente na suspensão celular. A medição em tempo real é conduzida aparando a sonda esterilizável foto-óptica a uma análise de imagem automatizada. Mudanças morfológicas aparecem com dependência do estado de crescimento e das condições de cultivo.

Resumo

O monitoramento in situ em bioprocessos microbianos é restrito principalmente a propriedades químicas e físicas do meio(por exemplo,valor do pH e concentração de oxigênio dissolvido). No entanto, a morfologia das células pode ser um indicador adequado para condições ideais, uma vez que muda com a dependência do estado de crescimento, acumulação de produtos e estresse celular. Além disso, a distribuição de tamanho unicelular fornece não apenas informações sobre as condições de cultivo, mas também sobre a heterogeneidade populacional. Para obter tais informações, foi desenvolvido um dispositivo de microscopia in situ foto-óptica¹ para permitir o monitoramento da distribuição de tamanho unicelular diretamente na suspensão celular em biorreatores. Uma análise de imagem automatizada é acoplada à microscopia baseada em um modelo neural da rede, que seja treinado com imagens usuário-anotadas. Vários parâmetros, que são obtidos a partir das capturas do microscópio, estão correlacionados ao processo de características relevantes das células, como sua atividade metabólica. Até agora, a série apresentada da ponta de prova da microscopia do in situ foi aplicada para medir o tamanho da pelota em suspensões filamentous dos fungos. Foi usado para distinguir o tamanho unicelular no cultivo de microalgas e relacioná-lo ao acúmulo de lipídios. A forma de partículas celulares foi relacionada ao brotamento em culturas do fermento. A análise da microscopia pode ser geralmente dividida em três etapas: (i) aquisição de imagem, (ii) identificação de partículas e (iii) análise de dados, respectivamente. Todas as etapas devem ser adaptadas ao organismo e, portanto, são necessárias informações anotadas específicas para alcançar resultados confiáveis. A capacidade de monitorar as mudanças na morfologia celular diretamente em linha ou on-line (em um desvio) permite valores em tempo real para monitoramento e controle, no desenvolvimento de processos, bem como na escala de produção. Se os dados off-line se correlacionarem com os dados em tempo real, as medições off-line tediosas atuais com influências desconhecidas no tamanho da célula se tornam desnecessárias.

Introdução

Características morfológicas das células são muitas vezes relacionadas ao estado fisiológico, uma conexão entre forma e função existe para muitas aplicações. A morfologia de uma única célula é influenciada pelo estado de crescimento, idade da célula, estresses ómóticos e outras células potenciais ou acúmulo de produtos. As mudanças morfológicas das células são muitas vezes uma medida da vitalidade do crescimento de uma cultura. Síntese de produtos intracelulares, acúmulo de lipídios em algas e formação corporal de inclusão em bactérias, entre outras, estão relacionados com o tamanho celular também. Aglomeração celular pode ser outro fator que vale a pena investigar co....

Protocolo

NOTA: Os seguintes passos são necessários para adaptar os parâmetros às respectivas condições de microrganismos e cultura. O ajuste das configurações da sonda dura cerca de 20 min para um usuário experiente. Uma descrição detalhada das ferramentas e etapas é dada no manual correspondente da ponta de prova de SOPAT GmbH. Em geral, são necessárias as ferramentas que são apresentadas no seguinte protocolo: (i) Controlador de sonda para ajustes de sonda e aquisição de imagem; (ii) Fiji (ImageJ) para anotações em imagens adquiridas; (iii) Suporte SOPAT para treinamento de rede neural artificial (ANN) e criação de fluxo de trabalho; (iv) Batch....

Resultados

A detecção do tamanho da pilha em culturas do fermento com o ISM e a deteção automatizada da imagem para distinguir entre pilhas de brotamento e non-budding foi conduzida com sucesso. Tanto a intensidade do stroboscope quanto a escolha da lacuna de medição têm uma gama de tolerância, na qual a identificação de partículas não é afetada. Por exemplo, as células de S. cerevisiae foram medidas com várias intensidades de estóscópio dentro de uma faixa de variação de 11% em uma concent.......

Discussão

O ISM apresentado aqui com os mesmos ou dispositivos muito semelhantes foi usado para medir a dinâmica morfológica de fungos, microalgas e células de levedura, o que possibilitou a determinação da atividade de crescimento e, em caso de algas, acúmulo de produtos intracelulares. O sensor não tem peças móveis e é diretamente aplicável em qualquer biorreator de tanque mexido padrão, seja através de uma porta padrão ou em um desvio estéril. Desde que o fermento é muito menor do que algas, a redução no tamanho da pilha exigiu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sensor MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, Alemanha	n.a.Sonda	microscópica monocular em linha Versão 2.1 com um software Mirco Flow
Cell versão v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Alemanha	n.a.Medidor
de espessura	n.n.Pode		ser qualquer fornecedor, DIN 2275:2014-03
Etanol 70%	n.n.Pode		ser qualquer fornecedor
Manual SOPAT Versão 2.0.5	SOPAT GmbH, Alemanha
Papel para lentes ópticas	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	tubos
código aberto de 50 mL	Pode ser qualquer fornecedor

de centrífuga cônicos de