स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि
Summary
आयन चैनलों की शुद्धि अक्सर चुनौतीपूर्ण है, लेकिन एक बार हासिल की, यह संभावित इन विट्रो कार्यों और चैनलों की संरचनाओं की जांच में अनुमति दे सकते हैं । यहाँ, हम स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए stepwise प्रक्रियाओं का वर्णन, एक परिवार के Ca2 +-सक्रिय सीएल चैनल.
Abstract
मानव जीनोम encodes चार bestrophin paralogs, अर्थात् BEST1, BEST2, BEST3, और BEST4 । BEST1, BEST1 जीन द्वारा इनकोडिंग, एक Ca है2 +-सक्रिय सीएल चैनल (CaCC) मुख्य रूप से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में व्यक्त. BEST1 के शारीरिक और रोग महत्व तथ्य यह है कि BEST1 जीन में २०० से अधिक विशिष्ट उत्परिवर्तनों आनुवंशिक रूप से इस तरह के रूप में सबसे अच्छा vitelliform के रूप में पांच रेटिना अपक्षयी विकारों, की एक स्पेक्ट्रम से जुड़ा हुआ है द्वारा डाला गया है धब्बेदार dystrophy (सर्वोत्तम रोग). इसलिए, एकल-अणु स्तर पर bestrophin चैनलों की भौतिकी को समझना जबर्दस्त महत्व रखता है. हालांकि, प्राप्त शुद्ध स्तनधारी आयन चैनल अक्सर एक चुनौतीपूर्ण काम है । यहां, हम BacMam baculovirus जीन अंतरण प्रणाली और अपनत्व और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा उनकी शुद्धि के साथ स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । शुद्ध प्रोटीन के बाद कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण में उपयोग किया जा करने की क्षमता है, ऐसे लिपिड bilayers और क्रि में electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में । महत्वपूर्ण बात, इस पाइपलाइन के कार्यों और अंय आयन चैनलों की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
Bestrophins1मनुष्यों के लिए बैक्टीरिया से अलग प्रजातियों के माध्यम से संरक्षित आयन चैनलों के एक परिवार के हैं । मनुष्यों में, BEST1 जीन, 12.3 11q गुणसूत्र पर स्थित है, झिल्ली प्रोटीन Bestrophin-1 (BEST1) है कि मुख्य रूप से रेटिना वर्णक उपकला की basolateral झिल्ली में व्यक्त किया है encodes (RPE) आंखों की कोशिकाओं2,3 ,4. ५८५ अमीनो एसिड, पहले ~ ३५० जिनमें से अत्यधिक प्रजातियों के बीच संरक्षित और अपने transmembrane क्षेत्र शामिल हैं, के शामिल BEST11,5,6मनुष्यों में एक CaCC के रूप में कार्य करता है । इसके अलावा, मुर्गियों और Klebsiella निमोनिया में BEST1 homologs7,8homopentamers के रूप में दोनों कार्य, विकास के दौरान संरक्षण के एक उच्च स्तर का सुझाव ।
मनुष्यों में, BEST1 जीन में २०० से अधिक उत्परिवर्तनों चिकित्सकीय1,9bestrophinopathies बुलाया रेटिना अध कि रोगों के एक समूह से जुड़ा हुआ है । उत्तम रोग, वयस्क-शुरुआत vitelliform dystrophy, autosomal प्रमुख vitreoretinochoroidopathy, autosomal अवकाश bestrophinopathy, और रेटनाइटिस pigmentosa3,4 सहित पांच विशिष्ट bestrophinopathies की सूचना दी गई है । ,10,11,12,13,14. इन रोगों, जो दृष्टि कम और भी अंधापन का नेतृत्व, वर्तमान में अनुपचारित हैं । आदेश में चिकित्सकीय उपचार और संभावित व्यक्तिगत दवा विकसित करने के लिए, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे इन BEST1 रोग-उत्परिवर्तनों के कारण समारोह और BEST115चैनल की संरचना को प्रभावित करते हैं । इन प्रयोजनों के लिए, शोधकर्ताओं ने शुद्ध bestrophin प्राप्त करने की आवश्यकता (जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती) चैनल और आचरण इन विट्रो में 5,8विश्लेषण ।
पहला महत्वपूर्ण कदम स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च प्रजातियों से bestrophin चैनलों की अभिव्यक्ति है । HEK293-F कोशिकाओं (BacMam प्रणाली) के baculovirus transduction के रूप में heterologously एक्सप्रेस झिल्ली प्रोटीन16,17के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, इस प्रोटोकॉल की मजबूत अभिव्यक्ति के लिए एक अनुकूलित BacMam वेक्टर (खूंटी BacMam) का इस्तेमाल लक्ष्य प्रोटीन18, जो इस मामले में एक स्तनधारी bestrophin homolog है । इस सदिश की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिंन झिल्ली प्रोटीन, जी सहित-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, परमाणु रिसेप्टर्स, और अंय आयन चैनल18। इस बात का भी प्रमाण है कि उत्पादित प्रोटीन18क्रि के लिए उपयुक्त हैं । HEK293-F कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ, प्रोटीन तो क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है; विशेष रूप से, bestrophins के मामले में, दोनों संबध और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी उपयोग किया जा सकता है ।
एक बार इस प्रोटोकॉल ठीक है एक bestrophin चैनल के लिए देखते, शुद्ध प्रोटीन तो planar लिपिड bilayer और एक्स-रे क्रि, क्रमशः5,8के माध्यम से अपने कार्य और संरचना के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इन तकनीकों bestrophins और अंय आयन चैनलों के कार्यात्मक और संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली पाइपलाइन प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और स्तनधारी bestrophin आयन चैनलों की शुद्धि के लिए एक उपयोगी पाइपलाइन का वर्णन करने के लिए भविष्य में इन विट्रो विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । जबकि FPLC डिवाइस आकार अपवर्जन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना NIH अनुदान EY025290, GM127652 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और रोचेस्टर शुरू की वित्त पोषण विश्वविद्यालय ।
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
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