Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях
Summary
Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол изучать белок белковых взаимодействий между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Этот метод подходит для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы на гипоксии.
Abstract
Низкой кислорода (гипоксии) вызывают различные меры адаптационного реагирования с гипоксией индуцибельной фактор 1 (HIF-1) комплекс, действуя в качестве главного регулятора. HIF-1 состоит из кислорода регулируется α субъединица гетеродимерная (HIF-1α) и конститутивно выразил β-субъединица (HIF-1β) также известен как арил углеводородов рецептор ядерной вступают (ARNT), регулирующие генов, участвующих в различных процессах, включая ангиогенеза , эритропоэза и гликолиз. Идентификация HIF-1 взаимодействуя протеины является ключом к пониманию гипоксии, сигнальный путь. Помимо регулирования HIF-1α стабильности гипоксия также вызывает ядерной транслокации многих факторов транскрипции, включая HIF-1α и ARNT. В частности большинство нынешних методов, используемых для изучения таких взаимодействий протеин протеина (ИЦП) основаны на системах, где уровни белка искусственно увеличить через гиперэкспрессия белка. Гиперэкспрессия белка часто приводит к не физиологические результаты, вытекающие из временных и пространственных артефактов. Здесь мы описываем модифицированных co иммунопреципитация протокола после лечения гипоксии с использованием эндогенного ядерных белков и как доказательство концепции, чтобы показать взаимодействие между HIF-1α и ARNT. В этом протоколе гипоксических клетки были собраны в гипоксических условиях и Дульбекко физиологический Phosphate-Buffered (DPBS) мыть буфер был также предварительно уравновешенной гипоксические условия перед использованием смягчения последствий деградации белка или комплекс белков диссоциация во время реоксигенацию. Кроме того ядерная фракций впоследствии были извлечены сконцентрироваться и стабилизировать эндогенного ядерных белков и избежать возможных ложных результатов, часто видели во время гиперэкспрессия белка. Этот протокол может использоваться для демонстрации эндогенных и родной взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях.
Introduction
Гипоксия происходит, когда недостаточно кислорода поступает в клетки и ткани тела. Она играет важную роль в различных физиологических и патологических процессах дифференцировки стволовых клеток, воспаление и рака1,2. Гипоксия индуцибельной факторов (HIFs) функции гетеродимерами состоит из кислорода регулируется α-субъединицы и конститутивно выраженной β-субъединица также известен как ARNT3. К настоящему времени было выявлено три изоформ субблоков HIF-α (HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α) и три HIF-β-субъединиц (ARNT/HIF-1β, ARNT2 и ARNT3). HIF-1α и ARNT повсеместно выражается, тогда как HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 и ARNT3 имеют более ограниченный выражение модели4. Комплекс белков HIF-1 является ключевым регулятором ответ гипоксии. В гипоксических условиях HIF-1α стабилизируется, затем translocates в ядро и последнего с ARNT5. Впоследствии этот комплекс связывается с конкретным нуклеотидов, известный как гипоксия реагировать элементов (HREs) и регулирует выражение генов-мишеней участвует в различных процессах, включая ангиогенеза, эритропоэза и гликолиз6. Помимо этого «канонической» ответ, гипоксия сигнальный путь также известен уровень помех с несколькими клеточный ответ, сигнальные пути как вырезка и ядерного фактора Каппа B (NF-κB)7,8,9.
Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для лучшего понимания гипоксии, сигнальный путь. В отличие от ARNT, которая нечувствительна к уровень кислорода и конститутивно выраженной, уровни белка HIF-1α плотно регулируется клеточного кислорода. В normoxia (21% кислорода) HIF-1α белки являются быстро деградированных10,11. Короткий период полураспада HIF-1α на normoxia представляет конкретные технические проблемы для обнаружения белка от выдержек клетки, а также для идентификации HIF-1α-взаимодействия белков. Кроме того несколько факторов транскрипции, в том числе HIF-1 комплекса перемещают в ядре при гипоксических условий12,,1314. Большинство нынешних методов, используемых для исследования PPI выполняются с использованием не физиологические гиперэкспрессия белков. Сообщается, что такие гиперэкспрессия белка причиной различных клеточных дефекты через несколько механизмов, включая перегрузки ресурсов, нейтро дисбаланс, неразборчивый взаимодействия и пути модуляции15,16. С точки зрения исследований PPI гиперэкспрессия белка может привести к ложный положительный, или даже ложные отрицательный, результаты в зависимости от свойства белков и функции гиперэкспрессия белка. Таким образом нынешние методы PPI исследований должны быть изменены для того, чтобы выявить физиологически соответствующих ИЦП в гипоксических условиях. Ранее мы продемонстрировали взаимодействие между HIF-1 и Ets семьи транскрипционный фактор GA-связывающий белок (GABP) в гипоксических P19 клеток, что способствует ответ промоутер Hes1 гипоксии17. Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол для изучения ИЦП между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Взаимодействие между HIF-1α и ARNT показано как доказательство концепции. Этот протокол предназначен для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях, включая, но не ограничиваясь идентификации HIF-1 взаимодействуя белками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Комплекс HIF-1-главный регулятор клеточного кислорода гомеостаза и регулирует множество генов, участвующих в различных клеточных адаптационного реагирования к гипоксии. Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для понимания гипоксических сигнала. Co Иммуноп?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доцент Sin Tiong Онг за использование рабочей станции гипоксии. Эта работа была поддержана следующее: Сингапур министерства образования, МО 1T1-02/04 и MOE2015-T2-2-087 (чтобы ю.а.), ли Конг Чиан школа медицины, Наньянг технологический университет начальный Грант M4230003 (P.O.B.), Шведский исследовательский совет, Фонд семьи Эрлинг Перссон, Фонд Ново Нордиск, Stichting аф Йокников фонд, Шведской ассоциацией диабета, страховая компания скандия, Диабет исследований и оздоровительный фонд, Фонд причала фон Канцов, Программа стратегических исследований в диабета на Каролинского института, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage и Фонд Рауля Валленберга Алиса и кнут.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
Referências
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D’Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genética. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O’brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes’: The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
