Co-immunoprecipitation analysen bruke endogene kjernefysiske proteiner fra celler kultivert Hypoxic vilkår
Summary
Her beskriver vi en co-immunoprecipitation-protokoll for å studere protein-protein interaksjoner mellom endogene kjernefysiske proteiner under hypoxic forhold. Denne metoden er egnet for demonstrasjon av samspillet mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer på hypoksi.
Abstract
Lavt oksygennivå (hypoksi) utløse en rekke adaptive svar med hypoksi-induserbart faktor 1 (HIF-1) kompleks som en master regulator. HIF-1 består av en heterodimeric oksygen regulert α undergruppe (HIF-1α) og constitutively uttrykt β delenhet (HIF-1β) også kjent som aryl hydrokarbon reseptor kjernefysiske translocator (ARNT), regulerer gener involvert i ulike prosesser inkludert angiogenese , erythropoiesis og Glykolysen. Identifikasjon av HIF-1 samspill proteiner er nøkkelen til forståelsen av hypoksi signalveien. I tillegg til regulering av HIF-1α stabilitet utløser hypoksi også kjernefysiske translokasjon av mange transkripsjonsfaktorer inkludert HIF-1α og ARNT. Spesielt, er de fleste av dagens metoder brukes til å studere slik protein-protein interaksjoner (PPIs) basert på systemer der protein nivå er kunstig økt gjennom protein overuttrykte. Protein overuttrykte ofte fører til ikke-fysiologiske resultater som følge av timelige og romlig gjenstander. Her beskriver vi en modifisert co-immunoprecipitation protokollen etter hypoksi behandlingssøkende endogene kjernefysiske proteiner, og som et bevis på konseptet, å vise interaksjonen mellom HIF-1α og ARNT. I denne protokollen, hypoxic cellene ble høstet under hypoxic forhold og Dulbecco’s Phosphate-Buffered saltvann (DPBS) vaskebuffer var også pre equilibrated hypoxic forhold før behandling å begrense protein fornedrelse eller protein kompleks dissosiasjon under reoxygenation. I tillegg kjernefysiske fraksjoner ble senere trukket ut å konsentrere seg og stabilisere endogene kjernefysiske proteiner og unngå mulige falske resultater ofte sett under protein overuttrykte. Denne protokollen kan brukes å demonstrere endogene og native interaksjoner mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer under hypoxic forhold.
Introduction
Hypoxia oppstår når utilstrekkelig oksygen angis til celler og vev i kroppen. Det spiller en avgjørende rolle i ulike fysiologiske og patologiske prosesser som stamcelleforskningen differensiering, betennelse og kreft1,2. Hypoksi-induserbart faktorer (HIFs) fungerer som heterodimerer består av en oksygen regulert α delenhet og en constitutively uttrykt β delenhet ARNT3også. Tre isoformene HIF-α underenheter (HIF-1α, HIF-2α og HIF-3α) og tre HIF-β underavdelinger (ARNT/HIF-1β, ARNT2 og ARNT3) har blitt identifisert hittil. HIF-1α og ARNT uttrykkes overalt, mens HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 og ARNT3 har mer begrenset uttrykk mønstre4. HIF-1 proteinet er viktig regulator av hypoksi respons. Under hypoxic forhold, HIF-1α blir stabilisert, translocates til kjernen og dimerizes med ARNT5. Deretter Dette komplekset binder til spesifikke nukleotider kjent som hypoksi forståelsesfull elementer (HREs) og regulerer uttrykket av målet gener involvert i ulike prosesser inkludert angiogenese, erythropoiesis og Glykolysen6. I tillegg denne “kanoniske” respons, hypoksi signalveien kalles også å crosstalk med flere cellulær respons signalnettverk trasé som hakk og kjernefysiske faktor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
Identifikasjon av romanen HIF-1 samspill proteiner er viktig for en bedre forståelse av hypoksi signalveien. I motsetning til ARNT, som ufølsom for oksygen og constitutively uttrykt, er HIF-1α protein nivå tett regulert av mobilnettet oksygennivået. På normoxia (21% oksygen) er HIF-1α proteiner raskt dårligere10,11. Den korte halveringstiden av HIF-1α på normoxia presenterer bestemte tekniske utfordringer for påvisning av protein fra cellen ekstrakter og identifikasjon av HIF-1α-samspill proteiner. Videre translocate flere transkripsjonsfaktorer inkludert de av HIF-1 komplekset i kjernen under hypoxic forhold12,13,14. De fleste av dagens metoder brukes for PPI studier utføres ved hjelp av ikke-fysiologiske overuttrykte proteiner. Slike protein overuttrykte har blitt rapportert til forskjellige mobilnettet defekter gjennom flere mekanismer, inkludert ressurs overbelastning, stoichiometric ubalanse, promiskuøse interaksjoner og veien modulering15,16. I PPI studier, kan protein overuttrykte føre til falsk positiv eller selv falsk negativt, resultater avhengig av protein egenskapene og funksjonene til overexpressed proteiner. Gjeldende metoder for PPI studier har derfor, for å avsløre de fysiologisk relevante PPIs under hypoxic forhold. Vi har tidligere vist samspillet mellom HIF-1 og Ets familie transkripsjon faktoren GA-bindende protein (GABP) i hypoxic P19 celler, noe som bidrar til responsen til Hes1 promoter hypoksi17. Her beskriver vi en co-immunoprecipitation-protokoll for å studere PPIs mellom endogene kjernefysiske proteiner under hypoxic forhold. Samspillet mellom HIF-1α og ARNT vises som et bevis på konseptet. Denne protokollen er egnet for å vise interaksjonen mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer under hypoxic forhold, inkludert men ikke begrenset til identifisering av HIF-1 samspill proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
HIF-1 komplekset er en master regulator mobilnettet oksygen homeostasis og regulerer en mengde tilblivelse involvert inne forskjellige mobilnettet adaptive svar til hypoksi. Identifikasjon av romanen HIF-1 samspill proteiner er viktig for forståelsen av hypoxic signaltransduksjon. Co-immunoprecipitation eksperimenter brukes vanligvis for PPIs studier for å avgrense mobilnettet signaltransduksjon trasé. Men protein overuttrykte er fremdeles mye brukt, og dette kan føre til eksperimentelle gjenstander. I tillegg HIF-1?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Assoc. Prof synd Tiong Ong for bruk av hypoksi arbeidsstasjonen. Dette arbeidet ble støttet av følgende: Singapore Utdanningsdepartementet, MOE 1T1-02/04 og MOE2015-T2-2-087 (til Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University oppstart grant M4230003 (til P.O.B.), den svenske Research Council, den Familie Erling Persson Foundation, Novo Nordisk stiftelsen Stichting af Jochnick Foundation, den svenske Diabetes Association, Scandia forsikringsselskapet, Diabetes Research og velvære Foundation, køye von Kantzow Foundation, den Strategisk forskningsprogram i Diabetes ved Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, og Knut og Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
Referências
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D’Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genética. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O’brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes’: The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
