Summary

Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Published: August 02, 2018
doi:

Summary

Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.

Abstract

Düşük oksijen düzeyleri (hipoksi) hipoksi-indüklenebilir faktörü 1 (kurulan-1) bir ana düzenleyici hareket karmaşık adaptif yanıt çeşitli tetikler. Kurulan-1 bir heterodimeric oksijen düzenlenir α birimi (kurulan-1α) oluşur ve yapısal genler angiogenez dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde dahil düzenleyen β alt birim (kurulan-1β) olarak da bilinen aril hidrokarbon reseptör nükleer ışınlama (ARNT), ifade , arttığından ve glikoliz. Kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması yolu sinyal hipoksi anlama anahtarıdır. Kurulan-1α istikrar düzenlemenin yanı sıra, hipoksi da kurulan-1α ve ARNT dahil olmak üzere birçok transkripsiyon faktörleri nükleer translocation tetikler. Özellikle, bu tür protein-protein etkileşimleri (PPIs) eğitim için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu nerede protein düzeyleri Yapay protein overexpression artan sistemleri temel alır. Protein overexpression kez zamansal ve mekansal yapılardan kaynaklanan fizyolojik olmayan sonuçlara yol açar. Burada biz değiştirilmiş bir co-immunoprecipitation tarif protokol endojen nükleer proteinler hipoksi tedavi sonrasında ve kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi göstermek için kavramının bir kanıtı olarak. Bu iletişim kuralı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullarda hasat edildi ve Dulbecco’nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) yıkama arabellek ayrıca protein yıkımı veya protein kompleksi azaltmak için kullanımdan önce hipoksik koşulları için önceden denge ayrılma sırasında reoxygenation. Ayrıca, nükleer kesirler daha sonra konsantre ve endojen nükleer proteinler stabilize ve sık görülen bir protein overexpression sırasında olası sahte sonuçları önlemek için elde. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve transkripsiyon Co düzenleyiciler hipoksik koşullarda endojen ve yerel Hofstede göstermek için kullanılabilir.

Introduction

Yetersiz oksijen hücre ve vücut dokuları sağlandığında hipoksi oluşur. Kök hücre farklılaşması, inflamasyon ve kanser1,2gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler kritik bir rol oynar. Hipoksi-indüklenebilir faktörler (HIFs) oluşan bir oksijen düzenlenir α alt birim ve yapısal ifade β alt birim olarak da bilinen ARNT3heterodimers işlev. Kurulan-α alt birimleri (kurulan-1α, kurulan-2α ve kurulan-3α) ve üç kurulan-β alt birimleri (ARNT/kurulan-1β, ARNT2 ve ARNT3) üç izoformlarının bugüne kadar tespit edilmiştir. Kurulan 2α, kurulan-3α, ARNT2 ve ARNT3 daha ifade desenleri4ile ilgili bir kısıtlama ise kurulan-1α ve ARNT ubiquitously, ifade edilir. Kurulan-1 protein kompleksi hipoksi yanıt anahtar düzenleyicisidir. Hipoksik koşullarda kurulan-1α stabilize hale gelir, o zaman için çekirdek translocates ve ARNT5ile dimerizes. Daha sonra bu karmaşık hipoksi duyarlı öğeler (Xact_s_lastresourcemanager) olarak bilinen belirli nükleotit bağlar ve anjiogenezi, arttığından ve glikoliz6dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde ilgili hedef genlerin ifade düzenler. Bu “kanonik” Yanıt yanı sıra, hipoksi sinyal yolu da crosstalk için birden çok hücre tepkisini yolları çentik ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) gibi sinyal ile bilinen7,8,9.

Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinlerin daha iyi yolu sinyal hipoksi anlamak için önemlidir. Oksijen seviyesi duyarsız ve yapısal ifade, ARNT aksine kurulan-1α protein düzeyleri sıkıca Hücresel oksijen düzeyleri tarafından düzenlenmektedir. Normoxia (% 21 oksijen) kurulan-1α hızla bozulmuş10,11proteinlerdir. Kurulan-1α kısa yarılanma normoxia, belirli teknik sorunlar hücre özleri protein tespiti için hem de kurulan 1α etkileşim proteinlerin tanımlanması için sunar. Ayrıca, hipoksik koşulları12,13,14altında çekirdek içine kurulan-1 kompleks de dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri translocate. ÜFE çalışmaları için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu fizyolojik olmayan overexpression proteinlerin kullanarak gerçekleştirilir. Bu tür protein overexpression kaynak aşırı yük, stokiometrik dengesizlik, önüne gelenle yatıp kalkan etkileşimleri ve yol modülasyon15,16da dahil olmak üzere birden çok mekanizmalar aracılığıyla farklı hücresel kusurları neden olduğu bildirilmiştir. ÜFE çalışmalar açısından yanlış pozitif veya bile yanlış negatif, sonuçlarına bağlı olarak protein özellikleri ve işlevleri overexpressed proteinlerin protein overexpression yol açabilir. Bu nedenle, ÜFE çalışmaları için geçerli yöntemleri fizyolojik ilgili PPIs hipoksik koşullarda ortaya çıkarmak için değiştirilmesi gerekir. Daha önce kurulan-1 ve Ets aile transkripsiyon faktörü Hes1 organizatörü yanıt hipoksi17katkı GA-bağlayıcı protein (GABP) hipoksik P19 hücrelerdeki arasındaki etkileşimi göstermiştir. Burada, bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasında PPIs çalışmaya açıklar. Kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi kavramının bir kanıtı olarak gösterilir. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve hipoksik koşullarda transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri gösteren için uygundur dahil ama bunlarla sınırlı olmamak üzere kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması.

Protocol

İnsan embriyonik böbrek 293A kullanır bu protokolü bölüm (HEK293A) hücre, s insan Araştırma Etik Komitesi Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur ve kuralları izler. 1. indüksiyon HEK293A hücrelerindeki hipoksi Dört 10 cm yemekleri ve tohum 3-5 x 10 mL Dulbecco’nın modifiye kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, takıma çanak başına 106 HEK293A hücre hazırlamak 110 mg/L sodyum pyruvate, 100 U/mL penisil…

Representative Results

Hücresel yanıt hipoksi, ifade olarak değerlendirmek için düzeyleri ve kurulan-1 karmaşık aşağıdaki hipoksi tedavi bileşenlerinin hücre altı yerelleştirme incelenmiş. HEK293A hücreleri 4 h için hipoksik koşullarda kültürlü veya normoxia denetimler olarak devam etti. Bütün hücre içinde kurulan-1α ve ARNT protein düzeyleri incelenmiş veya nükleer/sitoplazmik tarafından western blot ayıklar. Toplam hücresel lysates ARNT düzeyleri önemli ölçüde değildi, an…

Discussion

Kurulan-1 karmaşık Hücresel oksijen homeostazı bir ana Regülatörü ve genlerin farklı hücresel adaptif yanıt-e doğru hipoksi katılan bir bolluk düzenler. Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinler hipoksik sinyal iletimi anlamak için önemlidir. Co-immunoprecipitation deneyleri genellikle PPIs çalışmaları için hücresel sinyal iletim yollarının betimlemek için kullanılır. Ancak, protein overexpression hala yaygın olarak kullanılır ve bu deneysel eserler yol açabilir. Buna ek olarak, kurulan…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. günah Tiong Ong hipoksi iş istasyonu kullanım için teşekkür ederiz. Bu eser aşağıdaki tarafından desteklenmiştir: Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, MOE 1T1-02/04 ve MOE2015-T2-2-087 (için içeride), Lee Kong Chian Okulu tıp, Nanyang Teknoloji Üniversitesi açılış hibe M4230003 (P.O.B.), İsveçli Araştırma Konseyi Aile Erling Persson Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Stichting af Jochnick Vakfı, İsveç Diyabet Derneği, Scandia sigorta şirketi, diyabet araştırma ve Sağlık Vakfı, yatak von Kantzow’ın Vakfı, Diyabet, Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı Stratejik araştırma programı.

Materials

Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4  1st BASE 1415
Protein A/G Sepharose beads Abcam ab193262
Natural Mouse IgG protein Abcam ab198772
EDTA Bio-Rad 1610729
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
Nitrocellulose Membrane    Bio-Rad 1620112
Blotting-Grade Blocker Bio-Rad 1706404 Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS) Bio-Rad 1706435
10% Tween 20 Bio-Rad 1610781
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732
10x Tris/Glycine Buffer  Bio-Rad 1610771
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling 7076
SignalFire ECL Reagent Cell Signaling 6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Corning 21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Merck Millipore 52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody  Novus Biologicals NB100-124  Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha Antibody Novus Biologicals NB100-479 Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 Antibody Novus Biologicals NBP1-46218 Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein Kit Qiagen 37582 Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH Antibody Santa Cruz sc-47724 Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%) Sigma G5516
Potassium chloride Sigma P9541
RIPA buffer Sigma R0278
Sodium Chloride (NaCl) Sigma 71376
NP-40 Sigma 127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) Thermo Fisher Scientific 11995065
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific R0861
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270106
HEK293A cell line Thermo Fisher Scientific R70507
Methanol  Thermo Fisher Scientific 67-56-1
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets  Thermo Fisher Scientific 88660
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
QSP gel loading tip  Thermo Fisher Scientific QSP#010-R204-Q-PK 1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm Bio-Rad 1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561083
ChemiDoc XRS+ System Bio-Rad 1708265
I-Glove BioSpherix I-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader  BioTek BTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological Pipets Corning 4487
Costar 10mL Stripette Serological Pipets Corning 4488
Costar 25mL Stripette Serological Pipets Corning 4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes Corning 352095
Small Cell Scraper Corning 3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit  Gilson F167370 P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes Greiner Bio-One  616201
PIPETBOY acu 2 Pipettor INTEGRA Biosciences 155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets Justrite Manufacturing Co. 896000
Vortex mixer Labnet S0200
CO2 incubator NuAire NU-5820
Orbital shakers Stuart SSL1
Tube rotator SB3 Stuart SB3
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002470
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher Scientific 150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Thermo Fisher Scientific 69580 10K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices Thermo Fisher Scientific 69588
LSE Digital Dry Bath Heaters Thermo Fisher Scientific 1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 13-261-308
Software
Image Lab Software Bio-Rad 1709691

Referências

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D’Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genética. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O’brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes’: The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
check_url/pt/57836?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Zheng, X., Ho, C. Q. W., Zheng, X., Lee, K. L., Gradin, K., Pereira, T. S., Berggren, P., Ali, Y. Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57836, doi:10.3791/57836 (2018).

View Video