Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Abstract

Deze methode biedt een snelle aanpak voor de bepaling van het plasmamembraan partitioneren van elke fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne met behulp van de profielen van de intensiteit van de fluorescentie in het plasma-membraan. Gemeten fluorescentie profielen zijn voorzien van een model voor membraan en cytoplasma fluorescentie distributie langs een lijn die loodrecht op de rand van de cel toegepast. Dit model is opgebouwd uit de intensiteitswaarden van de fluorescentie in verwijzingen naar cellen, uiting van een marker van fluorescently gelabeld voor cytoplasma en met FM 4-64-geëtiketteerden plasma membraan. De methode kan worden toegepast op verschillende soorten cellen en organismen; echter kunnen alleen plasma membranen van niet-aangrenzende cellen worden geëvalueerd. Deze snel microscopie gebaseerde methode is geschikt voor de experimenten, waar subtiele en dynamische veranderingen van plasmamembraan-geassocieerde markers worden verwacht en moeten worden gekwantificeerd, bijvoorbeeldbij de analyse van de mutant versies van eiwitten, remmer behandelingen, en signaal transductie opmerkingen. De methode is geïmplementeerd in een multi-platform R-pakket dat is gekoppeld aan een macro ImageJ die als een gebruikersvriendelijke interface fungeert.

Introduction

Plasma-membraan verbond-geassocieerde eiwitten zijn de belangrijkste onderdelen van cel signalering trajecten. Een van hun fundamentele rol is hun voorbijgaande plasmamembraan associatie en dissociatie, die belangrijk is voor de signaaltransductie tussen het plasmamembraan en cytoplasma. Plasmamembraan verbond-geassocieerde eiwitten kunnen worden aangesloten op plasma membraan door lipide ankers (N-myristoylation, S-acylering of prenylation) of door lipide bindende domeinen (interactie met phosphatidylinositol fosfaten, phosphatidic zuur, etc.).

Plasma-membraan bindende eigenschappen van deze eiwitten kunnen worden onderzocht in vivo, bijvoorbeeldwanneer een fluorescently-tagged proteïne is gewijzigd door een plaats-geleide mutagenese van essentiële aminozuren, of wanneer het wordt behandeld met verschillende remmers beïnvloeden Lipide signalering. De verdelingen van perifere plasma membraaneiwitten worden meestal geëvalueerd kwalitatief, met name in gevallen, wanneer de herverdeling van eiwit duidelijk is. De onderhavige methode is optimaal voor situaties wanneer de herverdeling van de eiwitten is slechts gedeeltelijke en kwantitatieve beoordeling noodzakelijk is. Een veelgebruikte benadering van wanneer plasmamembraan vereniging wordt geschat uit confocale laser scanning microscopie beelden als een ratio van de intensiteit van de fluorescentie op het plasma-membraan en in het cytoplasma,^1,2, is simpel, maar niet nauwkeurig. Intensiteit van de fluorescentie op het plasma-membraan weerspiegelen een superpositie van het signaal van het plasma-membraan en cytoplasma vanwege het lichte diffractie-kenmerk voor de techniek van specifieke fluorescentie microscopie en optische elementen gebruikt³. Bijgevolg is de cytoplasmatische signaal ook opgenomen in de membraan-regio. Om deze reden worden niet als een masker voor een membraan signaal selectie⁴FM 4-64 kleuring patroon gebruikt. Bovendien eenvoudige metingen van membraan signaal op de positie die is gedefinieerd door de FM 4-64 kleuring maximale altijd systematisch overschat het signaal van de echte plasma-membraan van plasma-membraan verbond-geassocieerde proteïne als gevolg van de superpositie van de membraan en cytoplasmatische compound. Het maximum van waargenomen signalen voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde eiwitten ook doet niet mede lokaliseren met het maximum van de markering van het plasma membraan (dat wil zeggen, FM 4-64 styryl kleurstof), maar is verschoven naar het cytoplasma. Een andere beperking is gebaseerd op het feit dat de FM 4-64 uitstoot piek groter in vergelijking met de toppen van de emissie voor de groen fluorescente proteïnen zoals GFP als gevolg van de golflengte-afhankelijkheid van lichte diffractie^{3 is}.

In de hier beschreven methode, is het gecodeerde eiwit signaal door twee empirische functies, respectievelijk het beschrijven van een hypothetische verdeling van het plasmamembraan en het cytoplasma signaal, gemonteerd. Deze decompositie signaal wordt toegepast op lineaire fluorescentie-profielen die worden toegepast op het celoppervlak loodrecht op het plasma-membraan in de bronbeelden, die zijn regelmatige, twee-kanaals confocal secties fluorescently-tagged eiwit uiting te geven aan cellen voorzien van FM 4-64 kleurstof.

De eerste functie die wordt gebruikt voor montage beschrijft een diffractie van een signaal van het cytoplasma op de rand van de cel. Het wordt verkregen uit eerder verkregen fluorescentie-profielen die werden gemeten in cellen uiten een cytoplasma eiwit marker gelabeld door de dezelfde chromofore als het plasmamembraan verbond-geassocieerde proteïne van belang. De tweede functie beschrijven een diffractie van een plasmamembraan signaal is afgeleid van de fluorescentie van FM 4-64. Dit signaal wordt ten eerste benaderd door een Gauss functie die wordt gebruikt voor een geschatte modellering van lichte diffractie van een puntbron. In de tweede plaats is dit model, geldig voor rode FM 4-64 emissie, wiskundig getransformeerd naar het formulier die relevant zijn voor een golflengte van de emissie van de chromofore gebruikt voor de codering van zijdelings-geassocieerde eiwitten van belang op het plasma-membraan. Beide functies worden genormaliseerd door de maximale intensiteit en door het gemiddelde van 10% van de hoogste waarden voor FM 4-64 signaal en cytoplasmatische eiwit signaal, respectievelijk. Door deze ontleding van het signaal (niet-lineaire kleinste vierkante montage methode), kunnen de verhouding van het plasma-membraan en het cytoplasma breuk van het onderzochte eiwit worden geschat gemakkelijk en nauwkeurig. De echte fysieke dimensie van berekende partitionering coëfficiënt is in het bereik van micrometer, omdat cytoplasmatische volume concentratie wordt vergeleken met de oppervlakte concentratie op het plasma-membraan. Het definieert de afstand van het plasma-membraan naar het cytoplasma, waarbinnen de dezelfde hoeveelheid eiwitten is gelokaliseerd in het aangrenzende gebied van het plasma-membraan. Deze waarde is gelijk aan de partitionering coëfficiënt K₂ introduceerde eerder⁵. De methode is zeer snel, waarvoor slechts één confocal secties verworven met behulp van routine confocale laser scanning microscoop, en het vraagt niet om computationeel. De kern van de analyse is uitgevoerd in een draagbaar R-pakket en een extra ImageJ macro is geschreven om grafische gebruikersinterface voor het uitvoeren van de analyse van de intuïtieve dialoogvensters. Software en meer gedetailleerde beschrijving van de methode (verschenen eerder⁶) kan gevonden worden op http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

De methode is geschikt voor de geïsoleerde, protoplasten, weefsels en cellen, indien het plasma-membraan van afzonderlijke cellen duidelijk te onderscheiden is, uiting geven aan een fluorescently-tagged constructie van onderzocht ook-geassocieerde eiwit. Een chromofore compatibel met FM 4-64 kleuring moet worden gebruikt. FM 4-64 stoot rode fluorescentie; Daarom kan onderzocht eiwit worden gecodeerd door een fluorescentie eiwit met blauwe, groene of gele emissie (bijvoorbeeldGFP, GVB, YFP). Stabiele transformatie van biologisch materiaal wordt aanbevolen omdat hierdoor minder kunstmatig en meer reproduceerbare opmerkingen van eiwit verdeling. Het is noodzakelijk dat het onderzochte eiwit een relatief homogene cytoplasmatische distributie heeft. De lokalisatie van een eiwitten in het endoplasmatisch reticulum of een andere intracellulaire membraan compartiment kan kunstmatige resultaten opleveren.

Bovendien moet het hetzelfde biologisch materiaal uiting van een cytoplasmatische marker worden gebruikt voor de vergelijking. Cellen kunnen worden getransformeerd door een gratis chomophore (dezelfde als gebruikt voor perifere eiwitten tagging, bijvoorbeeldgratis GFP) of gecodeerde proteïne van belang met afgeschaft membraan bindingscapaciteit. Membraan bindingscapaciteit kan worden afgeschaft, bijvoorbeeld door trimmen van de membraan-bindend domein of plaats-geleide mutagenese van essentiële aminozuur residua (bijv., sites voor N-myristoylation, S-acylering, of prenylation, enz.).

Voor confocale scanning microscopie, moeten de cellen worden gemarkeerd door een membraan marker zoals FM 4-64 kleurstof. Als FM 4-64 kleuring is niet geschikt voor het bestudeerde materiaal (als gevolg van storende autofluorescence, slechte kleurstofpenetratie, enz.), kan het plasma-membraan worden aangeduid, bijvoorbeeld door integraal plasmamembraan eiwit een passende chomophore (tagged mCherry, RFP, enz.). Het is essentieel dat de markering te verwaarlozen lokalisatie in het membraan van de intracellulaire compartimenten (endomembranes is).

Als u werkt met vaste samples en antilichamen, kan corrigeerbare analoge FM 4-64FX of plasmamembraan labelen door antilichaam tegen een juiste target worden gebruikt. In dit geval, is het essentieel om te evalueren van de resultaten zeer zorgvuldig omdat fixatie procedures tot selectieve verlies van eiwitten uit zowel het cytoplasma en het plasma membraan leiden kunnen.

Protocol

1. bereiding van biologisch materiaal Biologisch materiaal uiten de fluorescently tagged proteïne van belang, evenals een cytoplasmatische marker voor te bereiden. Volg de procedures vermeld in de inleiding. 2. Confocale Laser Scanning Microscopie Vlekken van het materiaal opgesteld in sectie 1 met FM 4-64 kleurstof7. Een kleuring protocol die geschikt is voor het bestudeerde materiaal toepassen. Vlek 200 μL van celsuspensi…

Representative Results

DREPP10 is een plant-specifieke verbond-geassocieerde plasma-membraan eiwit dat is gekoppeld aan het plasmamembraan via een N-myristoylation en een elektrostatische interactie met phosphatidylinositol fosfaten11, 12. DREPP werd beschreven als een onderdeel van calcium-signalering in de plant cel machines en ook samenwerkt met het cytoskelet13,14. I…

Discussion

De hier beschreven methode genereert een nauwkeuriger schatting van het plasmamembraan partitioneren voor ook geassocieerde eiwitten in vergelijking met andere benaderingen gebaseerd op de meting van de fluorescentie intensiteiten⁵. De grote verbetering van deze methode is dat het houdt rekening met de lichte diffractie en superpositie van het plasma-membraan en de cytoplasmatische signalen. Hoewel deze methode resultaten in verband met de resultaten van een eenvoudige methode gebaseerd op de verg…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer