Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un análisis cuantitativo del nivel de Asociación de la membrana plasmática para fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteina. El método se basa en la descomposición computacional de membrana y citoplasmático componente de señal observado en células con marcador fluorescente membrana plasmática.

Abstract

Este método proporciona un enfoque rápido para la determinación de la membrana plasmática repartir de cualquier etiquetado fluorescente periféricamente proteína usando los perfiles de intensidad de la fluorescencia a través de la membrana plasmática. Perfiles de fluorescencia medidos están equipados por un modelo de distribución de fluorescencia de membrana y el citoplasma a lo largo de una línea aplicada perpendicularmente a la periferia celular. Este modelo se construye desde los valores de intensidad de fluorescencia en las células de referencia expresan un marcador etiquetado fluorescente de citoplasma y membrana plasmática 4-64-labeled de FM. El método puede aplicarse a diferentes tipos de células y organismos; sin embargo, sólo las membranas de plasma de las células vecinas no puede ser evaluadas. Este método rápido basado en la microscopía es conveniente para los experimentos, donde se esperan cambios sutiles y dinámicos de marcadores asociados a membrana del plasma y necesidad de ser cuantificada, por ejemplo, en el análisis de las versiones mutantes de proteínas, tratamientos de inhibidor, y observaciones de la transducción de la señal. El método está implementado en un paquete de R multiplataforma que se junta con una macro ImageJ que sirve como una interfaz fácil de usar.

Introduction

Proteínas de membrana plasmática periférica asociada son los componentes principales de vías de señalización celular. Uno de sus papeles fundamentales es su membrana plasmática transitoria asociación y disociación, que es importante para la transducción de la señal entre la membrana plasmática y citoplasma. Proteínas de membrana plasmática periférica asociada pueden fijarse en la membrana plasmática por anclajes de lípidos (N-myristoylation S-acilación y Prenilación) o dominios de unión a lípidos (interactuando con fosfatos de fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, etc.).

Vinculante de membrana plasmática de estas proteínas puede ser examinado en vivo, por ejemplo, cuando una proteína fluorescente etiquetado es modificada por una mutagénesis sitio-dirigida de los aminoácidos claves, o cuando se trata con diferentes inhibidores que afectan a lipídica de señalización. La distribución de las proteínas periféricas de membrana plasmática es principalmente evaluando cualitativamente, especialmente en los casos, cuando la redistribución de proteína es obvia. El método presentado es óptimo para las situaciones cuando redistribución de proteína sólo es parcial y evaluación cuantitativa es necesario. Un enfoque frecuente de cuando la Asociación de la membrana plasmática se estima de confocal laser escaneo imágenes de microscopia como una relación de intensidades de fluorescencia en la membrana plasmática y el citoplasma^1,2, es sencilla, pero no exacto. Intensidades de fluorescencia en la membrana plasmática reflejan una superposición de la señal de membrana plasmática y el citoplasma debido a la característica de la luz difracción para la técnica de microscopía de fluorescencia particular y elementos ópticos³. En consecuencia, la señal citoplasmática está incluida también en la región de la membrana. Por esta razón, patrón de coloración de FM 4-64 no puede utilizarse como una máscara para una membrana señal selección⁴. Por otra parte, simples mediciones de señal de la membrana en la posición definida por el FM 4-64 coloración máximo siempre sistemáticamente sobrestiman la señal real de membrana plasmática de la proteína de la membrana plasmática periférica asociada debido a la superposición de la membrana y citoplasmático compuesto. El máximo observados señales de fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteínas también co no localizar con la máxima del marcador de membrana del plasma (es decir, FM 4-64 styryl tinte), pero se cambia de puesto hacia el citoplasma. Otra limitación es que el pico de emisión de 4-64 es más amplia en comparación con los picos de emisión para las proteínas fluorescentes verdes como GFP debido a la dependencia de longitud de onda de la luz difracción³.

En el método descrito aquí, la señal de la proteína etiquetado está equipada por dos funciones empíricas que describen una distribución hipotética de la membrana plasmática y citoplasma, respectivamente. Esta descomposición de la señal se aplica a perfiles de fluorescencia lineal que se aplican a la superficie de la célula perpendicular a la membrana del plasma en imágenes de la fuente, que son secciones confocales regulares, dos canales de expresión de la proteína fluorescente etiquetado células etiquetadas con tinte de FM 4-64.

La primera función que se utiliza para el montaje describe una difracción de una señal de citoplasma en el borde de la célula. Se obtiene de perfiles previamente adquiridos de la fluorescencia que se midieron en las células que expresan un marcador de proteína del citoplasma etiquetado por el mismo cromóforo como la membrana plasmática periférica proteína de interés. La segunda función que describa una difracción de una señal de la membrana plasmática se deriva de la fluorescencia de FM 4-64. Esta señal se aproxima en primer lugar por una función Gaussiana que se utiliza para un modelado aproximado de difracción de la luz de una fuente puntual. En segundo lugar, este modelo, válido para la emisión de FM 4-64 rojo, se transforma matemáticamente en la forma que sea relevante para una longitud de onda de emisión del cromóforo utilizado para el marcado de proteínas asociadas periférica de interés en la membrana plasmática. Ambas funciones se normalizan por la intensidad máxima y la media de un 10% de los valores más altos para la señal de FM 4-64 y la señal de la proteína citoplásmica, respectivamente. De esta descomposición de la señal (método no lineal de ajuste cuadrados menos), la relación de la membrana plasmática y la fracción del citoplasma de la proteína examinada se pueden estimar fácilmente y con precisión. La dimensión física real del coeficiente de partición computada está en la gama del micrómetro, porque concentración volumen citoplásmico se compara con la concentración superficial en la membrana plasmática. Define la distancia entre la membrana plasmática y el citoplasma, dentro de los cuales la misma cantidad de proteínas se localiza en el área adyacente de la membrana plasmática. Este valor es equivalente a repartir coeficiente K₂ introducido anteriormente⁵. El método es muy rápido, requiriendo solos secciones confocales adquiridas mediante rutina láser confocal de barrido microscopio, y no es exigente computacionalmente. El núcleo de análisis ha sido implementado en un paquete portátil de R y una macro ImageJ adicional fue escrita para proporcionar la interfaz gráfica de usuario para ejecutar el análisis de los cuadros de diálogo intuitivos. Software y descripción más detallada del método (publicado anteriormente⁶) puede encontrarse en http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

El método es adecuado para células aisladas, protoplastos y tejidos, donde la membrana plasmática de las células individuales es claramente distinguible, expresando una construcción con etiqueta fluorescente de examinado proteína periférica asociada. Un cromóforo compatible con FM 4-64 la coloración debe ser utilizado. FM 4-64 emite fluorescencia roja; por lo tanto, proteína examinada puede ser etiquetada por una proteína de la fluorescencia con emisión azul, verde o amarillo (p. ej., GFP, PPC, YFP). Transformación estable de material biológico es recomendable porque permite observaciones menos artificiales y más reproducibles de la distribución de la proteína. Es necesario que la proteína examinada tiene una distribución relativamente homogénea citoplásmica. La localización de una proteína en el retículo endoplásmico o en otro compartimiento intracelular de la membrana puede producir resultados artificiales.

Además, debe utilizarse el mismo material biológico expresan un marcador citoplásmico para la comparación. Las células pueden ser transformadas por un chomophore libre (la misma utilizada para la proteína periférica etiquetado, por ejemplo, GFP gratis) o etiquetada proteína de interés con capacidad de unión de membrana suprimido. Capacidad de unión de membrana puede ser suprimido, por ejemplo, recortando el dominio de unión a membrana o por mutagénesis dirigida de residuos de aminoácido clave (por ejemplo, sitios de N-myristoylation, S-acilación, o Prenilación, etc.).

Para microscopía confocal, las células deben etiquetarse con un marcador de membrana como tinte de FM 4-64. Si FM 4-64 la coloración no es adecuado para el material estudiado (debido a la interferencia autofluorescencia, penetración de tinte pobre, etc.), la membrana plasmática pueden ser etiquetada, por ejemplo, por proteína integral de membrana plasmática con la etiqueta a una correspondiente chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Es esencial que el marcador tiene localización insignificante en los compartimentos de membrana intracelular (endomembranas).

Si trabaja con los anticuerpos y las muestras fijas, puede utilizarse fijable analógica FM 4-64FX o membrana plasmática etiquetado por el anticuerpo contra un objetivo apropiado. En este caso, es esencial para evaluar los resultados con mucho cuidado porque procedimientos de fijación pueden conducir a la pérdida selectiva de proteínas desde el citoplasma y la membrana plasmática.

Protocol

1. preparación de Material biológico Preparar el material biológico, expresando la proteína fluorescente etiquetada de interés, así como un marcador citoplásmico. Siga los procedimientos mencionados en la introducción. 2. confocal láser de barrido microscopía Mancha el material preparado en la sección 1 con FM 4-64 tinte7. Aplicar un protocolo de tinción que es apropiado para el material estudiado. Para las célul…

Representative Results

DREPP10 es una proteína de membrana de plasma periférico asociados específicos de planta que se asocia con la membrana plasmática por medio de un N-myristoylation y una interacción electrostática con el phosphatidylinositol fosfatos11, 12. DREPP fue descrito como un componente de la maquinaria de señalización de calcio en la célula de la planta y también interactúa con el citoesqueleto<sup class…

Discussion

El método aquí descrito genera una estimación más precisa de la membrana plasmática particionado en periférico asociadas proteínas comparadas con otros enfoques basados en la medición de intensidades de fluorescencia⁵. La principal mejora de este método es que toma en cuenta la difracción de la luz y la superposición de la membrana plasmática y las señales citoplasmáticas. Aunque estos resultados método están en correlación con los resultados de un método sencillo basado en la co…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer