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Imunologia e Infecção

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.

Abstract

Anticorps, appelés également comme différencient d’immunoglobulines (Ig), sécrétées par les lymphocytes B, plasmablasts/plasmocytes, immunité humorale fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes. Un objectif majeur de la vaccination est d’induire des anticorps spécifiques de l’antigène protecteurs pour prévenir les infections mortelles. Les antigènes de thymus-indépendants (TI) et dépendant du thymus (TD) peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) ainsi que la production de cellules B mémoire à l’aide fourni par antigène présentant des cellules (CPA). Nous décrivons ici un protocole afin de caractériser les réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Dans le présent protocole, les réponses de TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec des antigènes conjugués haptène modèle PNT-KLH (dans l’alun) et PNT-polysaccharide (PBS), respectivement. Pour induire la réponse mémoire TD, une vaccination de rappel du TNP-KLH dans l’alun est donnée 3 semaines après la première vaccination avec le même antigène/adjuvant. Sérums de souris sont récoltées à des moments différents avant et après la vaccination. Total sérique Ig et anticorps spécifiques PNT sont ensuite quantifiées à l’aide “sandwich” de Ig isotype-spécifiques et test ELISA indirect, respectivement. Afin de correctement quantifier la concentration sérique de chaque isotype Ig, les échantillons doivent être convenablement diluée pour s’adapter au sein de la gamme de linéarité des courbes standards. Utilisant ce protocole, nous avons toujours obtenu des résultats fiables avec sensibilité et une spécificité élevée. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec d’autres méthodes complémentaires tels que la cytométrie en flux, in vitro culture spléniques des cellules B et immunohistochemical souillant (IHC), ce protocole permettra aux chercheurs d’acquérir une compréhension globale des anticorps réponses dans un cadre expérimental donné.

Introduction

Les lymphocytes B sont le principal acteur dans l’immunité humorale et le seul type de cellules chez les mammifères qui sont capables de produire des anticorps, appelés également immunoglobulines (Ig)1,2. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris la neutralisation, opsonisation et activation du complément, conduisant à l’immunité protectrice3. Sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B n’est possible qu’après la pleine activation des cellules B spécifiques, qui nécessite, en principe que deux distincts des signaux3. Signal 1 est relayé par une liaison directe de l’antigène (Ag) pour le récepteur des cellules B (BCR) exprimé à la surface de cellules naïves spécifiques B3. Selon la source de Signal 2, activation des lymphocytes B se divisent en dépendant du thymus (TD) ou de thymus-indépendants (TI)3,4. Une réaction antigène de TD, 2 Signal est fourni par apparenté CD4 helper (TH) les lymphocytes T activés, qui expriment CD154, le ligand pour le récepteur de costimulation CD40 exprimé sur les cellules de B1,2,3. Une réaction antigène de TI, Signal 2 vient de l’engagement des récepteurs Toll-like (TLR dans le cas type 1 TI Ag) ou réticulation étendue des RCO (dans le cas type 2 TI Ag) sur le B cellules3,4. Antigènes de TI (TI-1) de type 1 sont des ligands microbiennes du TLR, y compris bactériens lipopolysaccharides (LPS), l’ARN viral et microbienne ADN CpG4,5. Antigènes de TI (TI-2) de type 2 ont une structure très répétitive et sont en mesure de livrer prolongée et persistante de signalisation à la cellule de B par réticulation multiples de la RCO4,6. TI-2 antigènes sont les polysaccharides antipneumococciques et polysaccharidiques conjugués haptène6,7. Les TD et TI antigènes peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) avec l’aide apportée par l’antigène présentant des cellules (CPA) telles que les cellules dendritiques (CD)1 ,2,3. En outre, antigènes TD et de TI sont capables d’induire des réponses de la mémoire à l’aide de TTB, mais TD antigènes sont plus efficaces pour induire la mémoire cellulaire B génération3,8.

Dans le présent protocole, les réponses TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec hémocyanine de patelle de 2,4,6-phényl-serrure d’antigènes conjugués haptène modèle (TNP-KLH) et PNT-polysaccharide (neutre, très ramifié et de masse élevée), respectivement9,10,11. Antigènes TD sont habituellement utilisés avec un adjuvant pour améliorer la production d’anticorps12. Ici, dans notre protocole, PNT-KLH est injecté à l’alun, un adjuvant couramment utilisé dans la vaccination études12. Autres exemples d’adjuvants qui peuvent être utilisés, complet ou incomplet de Freund (CFA ou IFA), monophosphoryl lipide A / dicorynomycolate de tréhalose (« Ribi » adjuvant) et CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. après l’immunisation, les sérums de souris sont récoltées à différents moments et anticorps PNT-spécifiques dans le sérum sont quantifiés à l’aide de Ig isotype-spécifiques enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA est un axée sur la plaque qui est largement utilisé comme un outil de diagnostic en médecine et aussi comme outil d’analyse en recherche biomédicale15,16. Il est utilisé pour la détection et la quantification des analytes, y compris les anticorps, hormones, cytokines, chimiokines et divers antigènes, etc.. ELISA peut être effectuée dans différents formats, y compris direct, indirect, sandwich et concurrentiel ELISA15,16. En général, il s’agit de l’immobilisation de l’antigène sur une surface solide, habituellement, une plaque de Microplaque 96 puits, qui est incubée avec l’anticorps primaire. Après incubation, l’anticorps non lié est éliminé. Dans un ELISA direct, l’anticorps primaire est directement conjugué à une enzyme (généralement la peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline), qui peut fendre un substrat chromogène pour produire un changement de couleur visible détecté par un instrument de détection de signal comme une spectrophotomètre15,16. En revanche, si un anticorps secondaire lié à l’enzyme est utilisé pour lier les anticorps primaire, alors cela est considéré comme un de15,ELISA indirect16. ELISA direct est plus rapide tandis que le test ELISA indirect est plus sensible15,16. Dans un “sandwich” ELISA, les plaques sont recouverts d’un anticorps de « capture » utilisé pour immobiliser l’antigène d’intérêt dans les échantillons, et puis l’antigène capturé peut être détectée par un autre anticorps « détection » dans une manière directe ou indirecte de15, 16. ELISA Sandwich offre une spécificité élevée étant donné que l’antigène est détecté par deux types d’anticorps de l’antigène. Dans un ELISA concurrent, la compétition s’établit entre l’antigène d’échantillon et l’antigène de la plaque de liaison pour la liaison à l’anticorps primaire, et puis la concentration de l’antigène dans l’échantillon est quantifiée par la mesure de la réduction du signal du substrat 15 , 16. ELISA concurrent peut être effectuée en utilisant le format direct ou indirect mentionné ci-dessus et est utile pour la détection des antigènes petits avec qu’un seul épitope15,16.

Des techniques alternatives pour la mesure des anticorps incluent radio-immunoessai (RIA),17de dosage par électrochimiluminescence (ECL) dosage et surface résonance plasmon (SPR). RIA a été le premier immuno-essai développé qui mesure la présence d’un antigène (ou anticorps) avec grande spécificité et une sensibilité à l’aide de réactifs radiomarquées18,19. Toutefois, en raison des préoccupations de toxicité radioactive, de coûts d’élimination, de conservation et de licences spéciales pour travailler avec des matériaux radioactifs, ELISA est un meilleur et plus pratique technique commun utilise20,21. ECL est un dosage très sensible dans lequel les réactions chimiluminescentes commencent à utiliser de l’électricité pour générer des espèces très réactives de précurseurs stables sur la surface d’une électrode et peuvent être utilisées pour mesurer la quantité d’analytes (tels que les antigènes ou les anticorps)22. Cependant, ECL nécessite un instrument spécial et est donc pas aussi largement utilisé comme ELISA23. SPR est un dosage direct qui peut être utilisé pour mesurer la fixation des ligands (e.g., anticorps) à immobilisé molécules (e.g., antigènes) sur un capteur à puce surface24. SPR détecte les interactions en temps réel très particulier et ne nécessite pas l’utilisation de réactifs marqués comme ELISA. Cependant, SPR nécessite un équipement spécial et a une sensibilité plus faible que ELISA17. Compte tenu des limites des méthodes alternatives, ELISA est la technique plus pratique et le plus appropriée pour notre but dans ce protocole. Nous décrivons ici l’utilisation du sandwich ELISA pour l’analyse des niveaux d’isotype Ig totales et les procédures de test ELISA indirect pour l’analyse des isotypes Ig spécifiques de l’antigène.

Protocol

Ce protocole suit les directives du Comité d’éthique institutionnel de recherche animale de l’Université Rutgers. Toutes les souris sont utilisés conformément aux lignes directrices des NIH et sous un animal protocole approuvé par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier. 1. préparation des souris et des Collection de sérums de souris naïves Gardez toutes les souris pour des expériences de vaccination à l’animalerie exempts d’agents pathogènes sp?…

Representative Results

Nous avons utilisé ce protocole pour enquêter sur le rôle d’un régulateur essentiel du système immunitaire, TRAF3, TI et TD Ig isotype réponses9,10,11. TRAF3 directement ou indirectement réglemente la transduction des signaux d’un certain nombre de récepteurs immunitaires innées et adaptatives, y compris de la superfamille des récepteurs TNF, récepteurs Toll-like et T cell receptor…

Discussion

Nous décrivons ici le protocole pour la caractérisation des réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide d’ELISA. Mise en œuvre réussie de ce protocole nécessite l’emploi de matériaux spécifiés dans le tableau 1, y compris les plaques de dosage ELISA, vaccination Ags, anticorps de souris Ig isotype-spécifiques et standards. Il faut éviter d’utiliser des plaques de culture de tissus traitée pour ELISA. Les dilutions des normes et des échantillons de sérum devraient être…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par les instituts nationaux de santé subventions R01 CA158402 (P. xxx) et R21 AI128264 (P. Xie), le Department of Defense accorder W81XWH-13-1-0242 (P. xxx), une bourse de pilote depuis le Cancer Institute du New Jersey par Grant nombre P30CA072720 de l’Institut National du Cancer (P. xxx), une subvention de recherche biomédicale de Busch (P. xxx), une bourse Stollar Victor (a. Lalani) et une Anne B. et bourse de James B. Leathem (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
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Referências

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– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
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