Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성
Summary
이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.
Abstract
또한 분 비 면역 글로불린 (Ig), B 세포, 체액 성 면역에서 plasmablasts/플라스마 세포 분화 되 나, 항 체는 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. 예방 접종의 하나의 주요 목표는 생명을 위협 하는 감염을 방지 하기 위해 보호 항 원 특정 항 체를 유도 하는 것입니다. 모두 thymus-종속 (TD)와 thymus-독립 (TI) 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어 낼 수 있습니다 또한 도움으로 메모리 B 세포의 생성 뿐만 아니라 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 항 원 제시 세포 (Apc)에 의해 제공. 여기, 우리는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여 마우스에 TD 및 TI Ig isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답은 elicited 쥐에 hapten 활용 모델 항 (졸업생)에 TNP KLH와 (PBS)에 TNP-다 당 류와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 각각. TD 메모리 응답을 유도, 졸업생에 TNP KLH의 부스터 예방 접종 같은 항 원/보조 제와 함께 첫 번째 접종 후 3 주에 제공 됩니다. 예방접종 전후 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확. 총 혈 청 Ig 수준 그리고 TNP 특정 항 체는 이후 각각 Ig isotype-특정 샌드위치 및 간접적인 ELISA를 사용 하 여 계량. 올바르게 각 Ig isotype의 혈 청 농도 측정, 샘플 표준 곡선의 선형 범위에 맞게 적절 하 게 희석 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도. Cytometry, 비장 immunohistochemical 및 B 세포의 생체 외에서 문화 다른 상호 보완적인 방법으로 사용 하는 경우 얼룩 (IHC),이 프로토콜을 허용할 것 이다 항 체의 포괄적인 이해를 얻기 위해 연구원 주어진된 실험 설정에 응답 합니다.
Introduction
B 림프 구 체액 성 면역에 주요한 선수 및 포유류 생산 항 체, 면역 글로불린 (Ig)1,2라고도 할 수 있는 유일한 셀 형식이 있습니다. B 세포에 의해 은닉 하는 항 체 중립화, 보완 활성화, 보호 면역3선도, opsonization 등 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. B 세포에 의해 항 체의 분 비는 일반적으로 두 가지 신호3특정 B 세포의 전체 활성화 후만 이루어집니다. 신호 1 B 세포 수용 체 (BCR) 특정 순진한 B 셀3의 표면에 표현 하는 항 원 (Ag)의 직접 바인딩에 의해 릴레이 됩니다. 신호 2의 원본에 따라 B 세포 활성화 thymus (TD) 또는 thymus-독립 (티)3,4로 나눌 수 있습니다. TD 항 응답에서 신호 2는 세포에 의해 활성화 된 동족 CD4 T 도우미 (TH), CD154, co-stimulatory 수용 체 CD40 B 세포1,2,3에 대 한 리간드를 표현 하는 제공 됩니다. TI 항 응답에서 신호 2 수용 체 통행세 같이의 어느 약혼에서 온다 (타입-1의 경우 TLRs TI Ag)는 BCRs의 광범위 한 cross-linking 또는 (2 형의 경우 TI Ag)는 b 세포3,4. 타입-1 티타늄 (TI 1) 항은 TLRs, 세균성 lipopolysaccharides (LPS), 바이러스 성 RNAs 등 미생물 CpG DNA4,5의 미생물 ligands. 2 형 티타늄 (TI-2) 항 원 높은 반복 구조, 있고 장기 및 영구 BCRs4,6의 여러 cross-linking에 의해 B 세포에 신호를 제공할 수 있습니다. TI-2 항의 전형적인 예로 폐 렴 구 균 다 당 류와 다 당 류 hapten 활용6,7있습니다. TD와 TI 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어내는 수 고 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 모 수석 세포 (DCs)1 에서 제공 하는 도움 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 2,3. 또한, TD와 TI 항 APCs의 도움으로 메모리 응답을 유도 하는 것 수 있지만 TD 항 메모리 B 세포 생성3,8유도에 더 효율적입니다.
이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답 TNP-다 당 류 (중립, 높은 분기 hapten 활용 모델 항 원 2,4,6-trinitrophenyl-열쇠 구멍 삿 hemocyanin (TNP KLH)와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 쥐에 elicited는 그리고 높은 질량), 각각9,,1011. TD 항 원 항 체12의 생산을 강화 하는 보조 일반적으로 사용 됩니다. 여기 우리의 프로토콜에 TNP KLH 졸업생, 면역 연구12에 일반적으로 사용 되는 보조로 주사 된다. 사용할 수 있는 adjuvants의 다른 예로 완전 하거나 불완전 한 Freund의 보조 제 (CFA 또는 아일랜드), monophosphoryl-지질 A / 트 레 할 로스 dicorynomycolate (“Ribi” 보조), 및 CpG oligodeoxynucleotides, 등13, 14. 예방 접종, 후 마우스 세라 다른 시간 지점에서 수확 하 고 세라에 TNP 특정 항 체 Ig isotype-특정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)9,10, 를 사용 하 여 계량은 11.
애 란은 의학에서 진단 도구와 또한 생물 의학 연구15,16분석 도구로 서 널리 사용 되는 접시 기반 분석 결과 이다. 그것은 감지 analytes 항 체, 호르몬, cytokines, 발산, 그리고 다양 한 항 원, 등등을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 됩니다. ELISA는 직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁적인 ELISA15,16를 포함 하 여 여러 가지 다른 형식에서 수행할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 일반적으로 결정 96 잘 접시, 기본 항 체와 알을 품는 고체 표면에 항 원 동원 정지를 포함 한다. 부 화, 후 언바운드 항 체는 멀리 세척 된다. 직접 ELISA에서 1 차적인 항 체는 효소 (일반적으로 양 고추냉이 과산화 효소 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소), 신호 검출 악기에 의해 감지와 같은 보이는 색상 변화를 비 기판 쪼개 다 수는에 직접 활용 한 분 광 광도 계15,16. 대조적으로, 효소 연결한 이차 항 체는 1 차 항 체를 바인딩하는 데 사용 됩니다, 다음이 간주 됩니다 간접적인 ELISA15,16. 직접 ELISA 간접적인 ELISA는 더 민감한15,16빠릅니다. 샌드위치 ELISA, 번호판, 샘플에 대 한 관심의 항을 무력화 하는 데 사용 하는 “캡처” 항 체로 코팅 하 고 캡처된 항 원 직접 또는 간접적인 방식으로15, 에 또 다른 “탐지” 항 체에 의해 검출 될 수 있다 16. 샌드위치 ELISA 항 원 antigen의 두 개의 서로 다른 항 체에 의해 감지 되 면 이후 높은 특이성을 제공. 경쟁적인 ELISA에서 경쟁 샘플 항 원 및 주 항 체 바인딩 위한 플레이트-바인딩 항 간에 설정 하 고 샘플에 있는 항 원 농도 기판에서 신호 감소를 측정 하 여 정량은 15 , 16. 경쟁 ELISA 위에서 언급 한 직접 또는 간접 형식을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 및 단지 1 개의 epitope15,16작은 항 원의 검출을 위한 유용.
항 체의 측정에 대 한 대체 기술을 포함 라디오-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) 분석 결과 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시험17. 리아 첫 번째 immunoassay 높은 특이성 및 방사선된 약18,19를 사용 하 여 감도 항 원 (항 체)의 존재 그 조치를 개발 했다. 그러나, 방사성 독성, 폐기 비용, 수명 및 방사성 재료와 함께 작동 하도록 특별 한 라이선스 문제로 인해 ELISA는 더 나은 하 고 일반에 대 한 더 편리한 기술20,21을 사용 하 여 키를 누릅니다. ECL은 chemiluminescent 반응 반응성이 매우 높은 종, 전극의 표면에 안정적인 선구자에서 생성 하는 전기를 사용 하 여 시작 되 고 analytes의 양을 측정 하는 데 사용 될 수 있는 매우 중요 한 분석 결과 (항 원 등 또는 항 체)22. 그러나, ECL 특별 한 계기를 요구 하 고 따라서 사용 되지 않습니다으로 광범위 하 게 일 라23. SPR은 직접 분석 결과 ligands의 바인딩은 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 (예., 항 체)를 분자를 움직일 수 (예., 항 원) 센서에 칩 표면24. SPR 매우 구체적으로 실시간으로 상호 작용을 감지 하 고 ELISA로 이라는 시 약의 사용을 요구 하지 않습니다. 그러나, SPR 또한 특별 한 장비를 필요로 하 고 ELISA17보다 낮은 감도 있다. 다른 방법의 한계를 감안할 때, ELISA는이 프로토콜에 우리의 목적을 위해 가장 적합 하 고 편리한 기술 이다. 여기, 우리는 총 Ig isotype 수준 분석 및 항 원 특정 Ig isotypes의 분석에 대 한 간접적인 ELISA의 절차에 대 한 샌드위치 ELISA 사용 하 여를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에 TD와 TI Ig isotype 응답 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현에는 표 1, ELISA 분석 실험 접시, 예방접종 Ags, 마우스 Ig isotype-특정 항 체 및 표준에에서 지정 된 재료 사용을 해야 합니다. 애 란에 대 한 치료는 조직 배양 배지를 사용 하지 않도록 주의 해야 합니다. 표준 및 혈 청 샘플의 희석 별도 치료 플레이트 (라운?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강 보조금 R01 CA158402의 국가 학회 (P. 시)에 의해 지원 되었다, R21 AI128264 (P. 시), 국방부의 부여 W81XWH-13-1-0242 (P. 시), 조종사 상 암 연구소의 뉴저지에서 보조금 번호 P30CA072720를 통해 국립 암 연구소 (P. 시), 부시 생명 부여 (P. 시), 빅터 Stollar 친교 (A. Lalani)는 앤 B. 그리고 제임스 B. Leathem 친교 (미 주).
Materials
| VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
| TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
| TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
| Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
| Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
| BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
| Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
| Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
| Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
| Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
| Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
| Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
| Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
| Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
| Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
| Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
| Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
| AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
| AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
| AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
| AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
| AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
| AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
| AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
| Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
| Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
| Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
| Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
| Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
| Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
| Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |
Referências
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