Denne artikkelen presenterer en protokoll for såing knappe populasjon av celler med pipette-tips for slippverktøy microfluidic enheter for å gi høyere innkapsling effektiviteten av celler i dråper.
Blant ulike microfluidic plattform design brukte for mobilnettet analyse, gir slippverktøy-microfluidics et kraftig verktøy for å isolere og analysere celler på encellede nivå ved å fjerne påvirkning av eksterne faktorer på mobilnettet microenvironment. Innkapsling av celler i dråper er diktert av Poisson-fordelingen som en funksjon av antall celler i hver dråpe og gjennomsnittlig antall celler per antall slippverktøy. Primær celler, spesielt immunceller eller klinisk prøver kan bli knappe og tap-mindre innkapsling av celler fortsatt utfordrende. I dette papiret presenterer vi en ny metode som bruker pipette-tips for å belaste cellene slippverktøy-baserte microfluidic enheter uten betydelige tap av celler. Med ulike celletyper viser vi effektiv celle innkapsling i dråper som stemmer til innkapsling effektivitet spådd av Poisson-fordelingen. Vår metode sikrer tap-mindre lasting av celler til microfluidic plattformer, og kan lett tilpasses for nedstrøms enkelt celle analyse, f.eks dekode mobilnettet interaksjoner mellom ulike celletyper.
De siste årene, bruk av microfluidics som en robust og allsidig plattform for mobilnettet analyse på enkeltcelle nivå har raskt økt1. Disse plattformene gir høy gjennomstrømming screening av enkeltceller og biologiske molekyler med høy presisjon og følsomhet bruker veldig lite utvalg volum2,3,4. Blant forskjellige typer microfluidic design aktiverer slippverktøy-baserte plattformer høy gjennomstrømming analyse av enkeltceller ved å isolere dem i en vandige fasen slippverktøy omgitt av en ikke blandbar fase som gir presis og nøyaktig kontroll over mobilnettet microenvironment5,6. Slippverktøy-baserte microfluidics gir fleksibilitet til å isolere én eller flere celler i, både vandige og hydrogel dråper og er verdifull i utprøvende komplekse mobilnettet opptreden, som protein sekresjon eller cellular interaksjoner7, 8 , 9. signal- og kryss-snakk blant immunceller kan være påvirket av interaksjon med andre celler i microenvironment10. Isolering av enkeltceller i dråper gir en effektiv støyfri analyselaboratorium, uten påvirkning av miljøfaktorer for mer effektiv og nøyaktig resultater11,12. Endre utformingen av en dråpe-microfluidic plattform med flere viker lar innkapsling av flere celletyper å studere mobilnettet interaksjoner via cellen-sammenkobling12,13.
Prosessen med innkapsling av celler i dråper er tilfeldig og frekvensen av innkapsling av celler kan være statistisk bestemmes ved hjelp av formelen for Poisson-fordelingen14,15. Denne innkapsling kan anslås ved å vurdere gjennomsnittlig rente på ankomsten av celler i slippverktøy krysset og forutsatt at ankomsten av hver celle er uavhengig av andre celler16. Selv om uavhengige celle ankomst ikke kan garanteres, i tilfeller av tynt distribuert celler forutsetning av uavhengighet kan betraktes og sannsynligheten for et slippverktøy som inneholder én eller flere celler kan forutses som en funksjon av antall celler i hver dråpe og gjennomsnittlig antall celler per slippverktøy16,17. Siden denne estimering av mobilnettet innkapsling i dråper er avhengig av antall celler i hver dråpe, kan en foreslå at øker konsentrasjonen av cellene på innløpet øker gjennomsnittlig antall celler i hver dråpe 16. derfor for å sikre én celle innkapsling, celle konsentrasjonen må reduseres men dette ofte fører til et stort antall tomme dråper18.
Tap av celler under lasting av enten vedlegg, sedimentering, og/eller klumper i sprøyten, rør eller produksjon enhet er en vanlig ulempe ansvarlig for avvik av faktiske innkapsling verdier fra spådd innkapsling verdier19 . Dette problemet blir ytterligere overdrevet når seeding sjeldne immunceller eller klinisk eksemplarer som de er allerede mangelvare i befolkningen og innkapsling av bare noen celler, mye lavere enn forventet, inneholder ikke nok data for eksperimentanalyse. Presenterer antigener dendrittiske celler (PDC) er sjelden delsett av immunceller som bare utgjør ca 0.2 – 0,6 prosent av hele hvit blod celle befolkningen20. Disse cellene skille ut enorme mengder type I interferoner ved aktivering og dermed spille en avgjørende rolle i immunreaksjoner21. Når studere mobilnettet atferden til slike sjeldne celler i dråper, er det viktig å hindre tap av cellen under cellen såing og innkapsling22. Det er flere design relaterte utviklingen som har sikret innkapsling av enkeltceller i dråper med aktive innkapsling metoder som bruker ulike fysiske krefter som akustisk eller elektrisk styrker for generering av dråpestørrelse inneholder Single-celler23,24. Men har disse metodene sine egne begrensninger i slippverktøy produksjon16.
I denne studien etablert vi en robust og enkel metode som omgår manglene ved tradisjonelle metoder for å laste inn én eller flere celler til microfluidic enheter. Vår metode, inspirert av Rho et al., utnytter forskjellig størrelse pipette-spisser for såing små mengder sjeldne immunceller dråpe microfluidic plattformer uten signifikant utvalg tap og gitt resultater som er sammenhengende med teoretisk spådommer25. Denne metodikken lett og vellykket for flere programmer med slippverktøy-basert microfluidics og gjeldt for en rekke celletyper eller selv microparticles.
I denne protokollen, har vi vist en effektiv og enkel teknikk og kapsle celler i dråper for høy gjennomstrømming, én celle analyse og utføre kontrollert celle sammenkobling for mobilnettet samhandling studier. Videre har vi sammenlignet flere konvensjonelle metoder for å laste inn celler til microfluidic enheter og viste at vårt tips lasting tilnærming er en mer effektiv teknikk i forhold til andre metoder.
Studere klinisk prøver eller sjeldne celletyper mangelvare i nummer av droplet-baserte microfluidics har noen iboende utfordringer. Som vi har også vist, pleier celler å sedimenter i sprøyter og overflaten av forbindelsesslangen, dermed hindre mobilnettet innkapsling for å oppfylle normalverdiene. For å unngå dette problemet, bruker enkelte grupper gripende barer i sprøyter. Men når du bruker sjeldne og begrenset celle populasjoner, total-celle volumet er også begrenset, dermed begrense bruk av store sprøyter og stirring barer. Videre vi også erstattet mer brukte rør med Teflon belagt rør for å hindre celle vedlegg, men denne metoden ble ikke bedre resultatene og hvis forbindelsesslangen er for lang, problemet med cellen vedlegg forverrer (data ikke vist). Også brukte vi et vertikalt rør lasting tilnærming der cellene var lastet slangen og ikke i sprøyten for å hindre tap av celler i stor sprøyte volumer. Bruker denne teknikken, lastes celler med lite utvalg volum inn, f.eks PDC som er sjeldne og begrenset. Også lastes eksemplet fra slangen til enheten vertikalt for å hindre celle sedimentering. Rør som brukes for cellen frø er små og kan sammenlignes med microchannels. Flyten slangen er trykket drevet og følger en parabolske hastighet profil26. Dette innebærer at det maksimalt er i midten av slangen og minimum hastighet er kantene av rør27. Når en populasjon av celler gjennom slangen, fører hastighet graderingen til at cellene å bli presset mot kantene hvor de slå seg ned fordi hastigheten på grensen er nær null. Den sedimentering eller oppgjør av celler i forbindelsesslangen, dermed reduserer innkapsling effektiviteten som vist i representant resultatene der eksperimentelle data ikke samsvarte med forventede modellen.
En annen vanlig tilpasset løsning brukes av forskere, arbeider med slippverktøy microfluidics, er å øke tettheten av celle kultur media med tillegg av matchende reagenser som Iodinaxol å hindre celle sedimentering i sprøyter19. Men tetthet matchende reagenser kan påvirke mobilnettet atferd og negativt påvirke cytokin utskillelsen av celler (data ikke vist)28.
Selv om flere små og store endringer i konvensjonelle celle lessing teknikker viste overse forbedringer i innkapsling effektivitet, innhentet eksperimentelle resultatene fortsatt samsvarte ikke med teoretiske beregninger. Men spissen lasting tilnærming kunne vi de overvinne begrensningene til tidligere metoder og innkapsling effektivitet styrt av Poisson statistikk. Denne teknikken er ikke bare fordelaktig for lasting suspensjon celler, men kan også brukes for lasting tilhenger celler, for eksempel primære keratinocytter og A549 til microfluidic-prosessorene. Når du bruker rikt cellelinjer, for eksempel A549, K562, etc., kan større sample volum brukes. Derfor avhengig av prøven, forskjellige størrelser pipette-tips kan også brukes, og denne enkle teknikken kan tilpasses for både encellede innkapsling og flere celle innkapsling.
Mens lav celle konsentrasjon kreves slik innkapsling av enkeltceller i dråper, er høyere celler konsentrasjoner ønsket å øke gjennomsnittlig antall celler innkapslet i hver dråpe for studier knyttet til celle paring. Det finnes flere encellede metoder som er tidligere beskrevet å par immunceller på microfluidic chips eller microfabricated nanowells29,30,31. I dråpe microfluidics tilsier Poisson statistikk at 1:1 celle sammenkobling for to forskjellige celletyper oppnås ved optimal celle konsentrasjoner. Basert på Poisson prediksjon, er det også en sannsynlighet at dråper kan inneholde andre kombinasjoner. Mens 1:1 celle sammenkobling kan være ønskelig å studere mobilnettet samhandlinger på én celle og resulterer i økt mobilnettet forståelse, har flere celle sammenkobling også store fordeler. Det tillater for å forstå innflytelsen av flere celler i én celle type på andre celle type. Kryss-snakk mellom ulike immunceller hjelpe generere en effektiv immunrespons mot flere infeksjoner og patogener og legger også til robusthet våre immunsystem32. Som sådan, kan mobil kommunikasjon bli avhørt med høy presisjon i forskjellige kontekster, f.eks 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, etc. gir økt forståelse om hvordan single eller par celleområde styre induksjon av immunreaksjoner. Dette er spesielt interessant å studere for eksempel kapasiteten til naturlige drepe celler eller cytotoxic T celler for serielt drepe deres respektive målcellene.
Som omtalt, for flere innkapsling av celler i dråper, er høyere celle konsentrasjoner ønsket. Men når lasting celler fra en åpning for cellen innkapsling, høyere konsentrasjoner av celle utvalg kan forårsake celler til samlet på innløpet. Dette resulterer i lavere innkapsling priser og høyere avvik av teoretiske verdier. For å unngå dette problemet, kan cellene lastes fra to separate innganger også. Teoretisk sett, det ville være mulig å utvikle andre microfluidic enheter med flere viker å oppnå enda høyere nivåer av cellen innkapsling der et gjennomsnitt på x antall celler garanteres. I denne studien undersøkt vi innkapsling effektiviteten av Jurkat T-celler når lastet fra en vik og to innganger med samme totale konsentrasjonen og fått lignende innkapsling effektivitet. Denne endringen gjør at forskerne å par forskjellige celletyper på chip.
Mens denne metoden hjelpemidler i lasting celler til microfluidic enheter uten betydelige tap av celler, er det visse forholdsregler som må holdes i bakhodet. Når du fyller sprøyter med mineralolje og aspirating celle eksemplet i pipette-spisser, inkorporering av luftbobler bør unngås og hele systemet skal være luft-fri. Det er også viktig å huske at mineralolje ikke bør blandes med prøven. Pipette-spisser, som inneholder eksempler, skal settes fast i viker på microfluidic enheten, med ytterste forholdsregel å hindre lekkasje og ytterligere innlemmelse av luftbobler. For å oppsummere, er tips-lasting en enkel, men, robust teknikk som gir høy gjennomstrømming analyse av mobilnettet atferd gjennom cellen innkapsling uten betydelige tap av celler på en kostnadseffektiv måte. Når den brukes med optimal eksempel konsentrasjoner på innløpet, denne tilnærmingen av lasting celler med pipette-tips er meget fleksibel og kan tilpasses til ulike celletyper, spesielt for sjeldne primære immunceller, å få høyere innkapsling effektivitet, nær anslått modeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Eindhoven University of Technology for sjenerøs støtte.
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol | Sigma-Aldrich | 171468-5G | |
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane | Fluorochem/UK | S13150 | Silane (toxic) |
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten | Fisher Scientific | 10630694 | Syringe |
Biopsy Punch 1.2 mm | Harris Uni-Core | ||
Cell Proliferation Dye eFluro 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
CellTrace Far Red Cell | Invitrogen | C34564 | |
Eppendorf Tubes | Eppendrof Tubes | Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL | |
Glass Slide | Sigma Aldrich | CLS294775X38-72EA | Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm |
Harvard Pumps | Harvard Apparatus | C-400750; C-400727 | Syringe pumps |
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid | Fluorochem/UK | 51243 | Flourinated oil |
Kai Biopsy Punch 5 mm | Amstel Medical | 1980130 | |
Luer stub | Instechlabs/USA | LS20S | Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile |
Mineral oil (Light) | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Tablets |
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) | Sphere Fluidics | 020317-09 | Surfactant |
Plasma Asher | Emitech | K1050X | Plasma asher |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
Silicone Elastomer Base 184 | Sylgard | 9355218 | PDMS base |
Silicone Elastomer Curing Agent | Sylgard | 9355218 | Curing Agent |
Stainless steel catheter coupler | Instechlab/USA | SC20/15 | 20ga x 15mm, non-sterile |
TFE Teflon Tubing | Sigma-Aldrich | 58696-U | PTFE Tubing L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in. |
Thinky mixer ARE-250 | EX-4025F | Conditioning mixture |