Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

Summary

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Abstract

In-vivo Mausmodellen Brust Krebs Fortschreiten zu beurteilen sind unerlässlich für die Krebsforschung, einschließlich der präklinischen Medikament Entwicklungen. Der Großteil der praktischen und technischen Daten entfallen jedoch häufig in veröffentlichten Manuskripte, die daher, macht es schwierig, um die Modelle zu reproduzieren, besonders wenn es um chirurgische Techniken geht. Biolumineszenz Technologie ermöglicht die Auswertung von geringen Mengen von Krebszellen auch wenn ein Tumor nicht greifbar ist. Verwendung von Krebszellen Luciferase-zum Ausdruck zu bringen, schaffen wir eine Brust Krebs orthotopen Inokulation Technik mit einer hohen Tumorgenese. Lungenkrebs Metastasen ist ein ex-Vivo -Technik bewertet. Wir etablieren dann eine Mastektomie-Modell mit einer niedrigen lokale Rezidivrate der metastatischen Tumorlast zu beurteilen. Hierin beschrieben, detailliert, die Operationstechniken der orthotopen Implantation und Brustamputation für Brustkrebs mit einer hohen Tumorgenese und niedrigen lokalen Rezidivraten bzw. zur Verbesserung der Brust Krebs Modell Effizienz.

Introduction

Tiermodelle spielen eine Schlüsselrolle in der Krebsforschung. Wenn eine Hypothese in vitro nachgewiesen ist, sollte es in-vivo auszuwertende ihre klinische Relevanz geprüft werden. Tumorprogression und Metastasierung sind oft besser von Tiermodellen im Vergleich zu in-vitro-Modelle erfasst, und es ist wichtig, ein neues Medikament testen in einem Tiermodell als einer präklinischen Studie für Droge-Entwicklung^1,2. Die technischen Details von Tierversuchen sind jedoch oft nicht gut beschrieben in veröffentlichten Artikeln, so dass es eine Herausforderung, das Modell erfolgreich zu reproduzieren. In der Tat ging die Autoren, die diese orthotopen Inokulation und Mastektomie Modelle hergestellt durch langen und strengen Prozesse von Versuch und Irrtum. Die Erfolgsquote bei der Tumorgenese nach Krebs Zelle Impfung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg und die Effizienz eines Tieres studieren³. Die Zell-Linie und die Anzahl der Zellen zu impfen, die Impfung-Website und die Belastung der Mäuse sind alle wichtigen Faktoren. Es ist bekannt, dass es große Unterschiede in den Ergebnissen von Tierversuchen durch individuelle Unterschiede im Vergleich zu in-vitro-Techniken gibt. Daher ist es wichtig, stabile Ergebnisse zur Verbesserung der Effizienz von Tierversuchen und irreführende Ergebnisse zu vermeiden, mit einem etablierten Modell mit einem standard-Technik.

Dieses Dokument enthält etablierte Techniken⁴ um Brust Krebs orthotopen und Mastektomie Mausmodellen zu generieren. Die Ziele dieser Methoden sind 1) menschliche Muttermilch Tumorprogression und Behandlungszyklen zu imitieren, und (2) in vivo Experimente mit mehr Effizienz und höhere Erfolgsraten im Vergleich zu anderen Brust-Krebs-Impfung oder Mastektomie Techniken. Im orthotopen Krebs Zelle Inokulation um menschliche Muttermilch Tumorprogression, imitieren wählen wir #2 Mamma Fettpolster als Impfung Website, befindet sich in der Brust. In den meisten Studien, Brustkrebs-Zellen werden subkutan geimpft⁵. Diese Technik erfordert keine Operation, und so ist es einfach und unkompliziert. Die subkutane Mikroumgebung unterscheidet sich jedoch von der Brustdrüse Mikroumgebung, die Ergebnisse in verschiedenen Tumorprogression und auch molekularer Profile^6,7. Einige Studien verwenden #4 Brustdrüse, die sich in der Bauchhöhle befindet, als eine Impfung Seite⁶. Da jedoch #4 Milchdrüsen in der Bauchhöhle befinden, ist die häufigste metastasierendem Muster peritonealen Carcinomatosis⁷, die mit weniger als 10 % von metastasierendem Brustkrebs Krebs⁸auftritt. Generiert durch die Technik in der Brustdrüse #2 das hier vorgestellte Brustkrebs metastasiert in die Lunge, die eines der häufigsten Brust Krebs metastasiertem Websites⁹ist.

Mit dieser Technik soll auch eine höhere Tumorgenese mit minimalen Tumor Größe Variabilität im Vergleich zu anderen Brust Krebs Impfung zu erzielen. Hierzu sind Krebszellen, die in eine gallertartige Proteinmischung ausgesetzt unter direkter Sicht durch einen medianen vorderen Brust Wand Schnitt geimpft. Diese Technik sorgt für eine hohe Tumorgenese Rate mit weniger Variabilität in der Größe des Tumors und Form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgische Injektion, wie bereits berichtet^3,7.

Wir führen auch eine Maus radikale Mastektomie Technik in der orthotopen Brusttumor mit dem umliegenden Gewebe und axillären Lymphknoten reseziert wird. In der klinischen Einstellung ist die Standardtherapie für Patientinnen mit Brustkrebs ohne Fernmetastasen Krankheit Mastektomie^10,11. Bevor eine Mastektomie wird axillären Lymphknoten-Metastasen von Bildgebung und Sentinel-Lymphknoten-Biopsie befragt. Wenn es keinen Beweis der axillären Lymphknoten-Metastasen gibt, ist der Patient dann mit eine vollständige oder partielle Mastektomie, behandelt in der axillären Lymphknoten-Resektion weggelassen wird. Totale Mastektomie ist eine Technik, um Brustkrebs mit das ganze Brustgewebe en bloc zu resezieren, während partielle Mastektomie Brustkrebs mit einer Marge von umgebenden normalen Brustgewebe, resezieren somit Erhaltung der verbliebenen normalen Brustgewebe in der Patienten. Patienten, die Erhaltung normalen Brustgewebe nach einer partiellen Mastektomie verbleibende erfordern jedoch postoperative Strahlentherapie Lokalrezidiv¹⁰zu vermeiden. Patienen mit axillären Lymphknoten-Metastasen, die radikale Mastektomie verpflichten sich, wodurch das Brustkrebs mit allen normalen Brust-Gewebe und axillären Lymphknoten und marschierte in Geweben En Bloc^10,11. Im Mausmodell ist die Überwachung für axillären Lymphknoten Metastasen und/oder postoperative Bestrahlung nicht sinnvoll oder machbar. So nutzen wir die radikale Mastektomie-Technik zur Vermeidung von lokalen oder axillären Lymphknoten-Metastasen.

Krebs Zelle Beimpfen über die Rute Vene ist die am weitesten verbreitete Lunge Metastasen Maus Modell¹², die so genannte “experimentelle Metastase”. Dieses Modell ist leicht zu generieren und erfordert keine Operation; jedoch ist es nicht menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren die verschiedenen Metastasen Verhalten führen können. Um die menschliche Brust Krebs Behandlung natürlich imitieren wo Metastasierung häufig nach Mastektomie tritt, ist nach der orthotopen Krebs Zelle Inokulation der Primärtumor entfernt. Diese Technik erzeugt weniger Lokalrezidiven im Vergleich zu einfachen Tumor-Resektion, wie bereits berichtet¹³, und eignet sich für neuer Therapeutika, präklinische Studien und für metastasierendem Brustkrebs Krebs Forschungsstudien. Die hier beschriebenen Techniken sind für die meisten Brust Krebs orthotopen Modellversuche. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die gallertartige Proteinmischung die Mikroumgebung beeinflussen und Operation Stress/Immune Antwort^{14 beeinflussen}. Daher sollten Forscher studieren die Mikroumgebung und/oder Stress/Immunantwort Potenzial Störfaktoren berücksichtigen.

Protocol

Die Genehmigung vom Roswell Park umfassende Cancer Center institutionelle Animal Care und Use Committee war für alle Experimente. Hinweis: Neun bis zwölf Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen stammen. 4T1-luc2 Zellen, eine Maus Mamma Adenokarzinom Zelllinie von BALB/c Mäusen abgeleitet, die auf ausdrücklichen Luciferase entwickelt, hat dienen. Diese Zellen sind in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert. <p cla…

Representative Results

Orthotopen Modell soll imitieren menschlichen Krebs Fortschreiten (d. h., das Wachstum des Primärtumors gefolgt von Lymphknoten-Metastasen und dann entfernte Lunge Metastasen)15. Nach Krebs Zelle Inokulation, die Biolumineszenz wird quantifiziert, regelmäßig (zwei-bis dreimal / Woche) (Abbildung 1A). Die Biolumineszenz in der Lunge ist tiefer und kleiner als die primäre Läsion. Die Biolumineszenz spiegelt vor allem die pr…

Discussion

Für das letzte Jahrzehnt etablieren wir mehrere murinen Krebs-Modelle, einschließlich Brust Krebs Modelle^{3,7,13,16,20,21}. Bisher haben wir gezeigt, dass Brustkrebs Krebs Zelle orthotopen Inokulation in das Brustdrüsengewebe unter direkter Sicht einen größeren Tumor mit weniger Größe Variabilität im Vergleich zu injizi…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture