제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술
Summary
이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.
Abstract
산호는 바다의 전반적인 건강 뿐만 아니라 인간의 건강에 대 한 중요 한 중요 한 바다 무척 추 동물. 그러나, 상승 바다 온도 해양 산성화 등 인간의 영향으로 인해 산호는 점점 더 위협을 받고. 이러한 과제를 해결 하기 위해 세포 및 분자 생물학 산호의 건강 진단에 대 한 중요 한 것을 입증 했다. 인간의 의학에서 일반적으로 사용 되는 기법 중 일부를 수정 연구자의 능력을 치료 하 고 산호 저장에 크게 향상 시킬 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 현장에서 교 잡 인간의 의학 및 진화 개발 생물학에서 주로 사용 하는 프로토콜 스트레스 성인 산호에 사용 하기 위해 적응 되었습니다.
이 방법의 목적은 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분 된 성인 산호 조직에서 RNA 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 것입니다. 이 메서드는 파라핀 및 샘플의 재 수 화 작용의 제거, 샘플, 사전 교 잡 부 화, RNA 프로브의 교 잡 그리고 RNA 프로브의 시각화의 침투성을 보장 하기 위해 샘플의 전처리에 중점을 둡니다. 이 때 강력한 방법 비 모형 유기 체를 사용 하 여 특정 유전자가 표현 및 프로토콜은 다른 비 모형 유기 체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 방법은 식 강도 시각화 단계 및 프로브 농도 동안 사용 시간에 따라 달라질 수 있기 때문에 그것은 주로 질적 제한 됩니다. 또한,이 프로토콜 최대 5 일 (와 많은 경우에, 더 이상) 사용 되는 프로브에 따라 걸릴 수 있습니다 인내심 필요 하다. 마지막으로, 일반적인 배경 얼룩은 일반적, 그러나이 한계를 극복할 수 있습니다.
Introduction
산호는 중요 한 생태계 빌더 바다와 인간의 건강1,,23에서 생물 다양성에 대 한 중요 한. 그들은 기후 변화 및 다른 anthropogenic 스트레스 위협을 받고 있다 그리고 많은 산호 종 비판적으로 멸종 위기에 놓인 것으로 간주 됩니다. 따라서, 세포 및 분자 도구 진단 스트레스 산호를 위한 중요 한 필요가 있다. 또한, 거기 약간 이해 된다 성인 산호 조직, 그리고이 유전자의 기능에 따라서 작은 이해 내 유전자가 표현 하는 곳에 대 한. 이 문제를 해결 하려면 우리는 현장에서 교 잡 (틱), 일반적으로 사용 되는 프로토콜 인간의 의학 및 진화 개발 생물학, 성인 산호의 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 사용 하기 위해 적응 시켰다. 이 기술은 열 스트레스에 노출 등 스트레스 이벤트 받은 성인 산호에 사용 될 때 가장 강력 하다. 그러나,이 기술은 다양 한 조직 및 산호의 삶의 단계에 사용할 수 있습니다 그리고만 열 스트레스 산호4,,67에 국한 되지 않습니다. 또한,이 기술은 사용할 수 cDNA 순서 정보는 조직 또는 모든 metazoan의 셀에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 보존 및 파라핀에 포함 되었으며 슬라이드에 구분 성인 산호 조직 내의 RNA 프로브를 시각화 하는 것입니다. 이 방법은 성인 산호 조직 내에서 핵 산의 시각화에 대 한 허용 하는 강력한 진단 도구입니다. 처음에이 방법은 의료 진단에 대 한 개발 하 고 이후 발생 생물학 및 진화 개발 생물학8,,910분야에서 인기 있는 도구가 되고있다. 분의 비-모델 시스템, 게놈에서 특히 중요 한 방법 이기도 하 고 transcriptomic 시퀀스 데이터 사용할 수 있지만 공간 유전자 표현 패턴을 알 수 있습니다. 진단 작업 비 모델 시스템에 대 한이 기술은 강력 하다는 세포와 조직 관심사의 유전자를 표현 하 고 더 많은 타겟된 치료 접근8,,910, 이어질 수 있습니다 나타낼 수 있습니다 때문에 11,12. 마지막으로,이 기술은 질적 및 양적 유전자 표현 데이터11와 결합 하는 때 더 강력한입니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 이미 digoxigenin (발굴) 설계 연구원에 게 관심이 될 것입니다-표시 된 RNA 프로브 (감각 및 antisense 프로브)는 이제 제자리에서 교 잡의 샘플을 프로브를 실행할 준비가 되었습니다. 이 메서드를 수행 하기 위해 파라핀 산호 직물의 2 개의 직렬 섹션 테스트 중인 각 프로브에 대 한 필요 합니다. 한 섹션 감지 프로브 및 센스 프로브에 대 한 다른 사용 됩니다. 감각 프로브를 나타내는 일반적인 바인딩 컨트롤 될 것입니다. 만약 얼룩이 지는 감각 프로브에서 관찰, 센스 프로브 관심의 RNA를 특정 하지 않습니다. 프로브는 모든 유전자 표현에 대 한 디자인할 수 있습니다. 이 프로토콜에 몇 가지 예는 사용 이전 산호에 열 스트레스 동안 표현할 것을 발견 했다: FBJ murine 다리 바이러스 oncogene 체 B (포-B), 활성 단백질 (AP1), 종양 괴 사 인자 수용 체 41 (TNFR 41)11. 그들의 처리는 많은 안전10때문에 방사성 프로브를 사용 하 여 분 발굴 표시 된 RNA 프로브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한,이 기술은 매우 민감한 이며 다양 한 조직 및 열 스트레스 성인 산호13,14,,1516넘어 배아에서 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 의료 및 진화 발달 연구8,9,10,,1217이전 작품에서 수정 되었습니다. 이 프로토콜 발굴 표시 된 RNA 안티 감각 프로브는 보존 되 고 파라핀에 포함 된 성인 산호에 제자리에 하이브리드의 뉘앙스에 집중 한다. 이 메서드는 파라핀 포함 된…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 수상에 의해 투자 되었다 아니. OCE-버로우즈 Wellcome 펀드 박사 농축 프로그램에서 국립 과학 재단 해양 과학 박사 친목 및 수상 no.1012629 통해 1323652.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Referências
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