Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.
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Artigo de método
Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3' de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3' da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3' lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5'-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.
Introdução
As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.
Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combin....
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Protocolo
1. modelo de primer/preparação
- Projetar primers/modelos com um conteúdo de G + C equilibrado entre 40% e 60% como em uma sequência ou projeto da primeira demão PCR. Use as primeiras demão de 18 a 21 nt para um recozimento apropriado e melhores sinais de MS.
- O modelo de design, definindo a 50 ° C como o mínimo de temperatura para a região de frente e verso pelo menos 7 de fusão nt de 5'-saliência para separar os sinais entre o primer e o modelo.
Nota: por exemplo, para o substrato P21/T28 na tabela 1, o primer 21-nt é emparelhado com um modelo 28-nt. Opção: o uso de alternativos ácidos nucleicos tais como resistente a nuclease ph....
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Resultados
Primers e modelos:
Usando o procedimento apresentado aqui, igual modelos molar do oligonucleotide sintéticas e primers de sequências relevantes obtidas de fontes comerciais foram verificadas por sua pureza e qualidade (Figura 3A; note que os sinais combinados a massa designada e o baixo fundo) bem como para a relação entre o pico de intensidade e a massa do analito (
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Discussão
Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análises MALDI-TOF M.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a facilidade do núcleo integrado NCFPB genômica funcional (Taipei, Taiwan) e o laboratório de farmacogenômica NRPB (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação de saúde de Taiwan (L-Il) e o Ministério da ciência e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [mais 105-2320-B-002-047] para Hu Wei-Yao, [mais 105-2628-B-002-051-MY3] para Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] por Liang-na Lin.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Oligonucleotídeos | Missão Biotech (Taiwan) | ||
| oligonucleotídeos modificados com fosforotioato | DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) New | England Biolabs, MA | M0210L | |
| Fragmento de Klenow (3'→ 5' exo-) | New England Biolabs, miliampère | M0212L | |
| NEBuffer 2,1 (10X) | New England Biolabs, miliampère | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, conjunto dTTP | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| Matriz SpectroCHIP | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, software CA | ||
| Typer 4.0 | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Kit de ferramentas de resina limpa | Agena Bioscience, CA# | 08040 |
Referências
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA....
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Reimpressões e permissões
