Her præsenterer vi en protokol til live imaging sår reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på høj spatio-temporal opløsning i vivo. Denne metode udnytter Drosophila puppe udviklingstrin at muliggøre langsigtede imaging og sporing af specifikke cellepopulationer over tid og er kompatibel med effektiv RNAi-medieret genet inaktivering.
Under den hurtige inflammatoriske respons på vævsskader, er cellerne i medfødte immun-systemet hurtigt rekrutteret til skaden site. Én gang på såret, medfødte immun celler udføre en række væsentlige funktioner, såsom bekæmpelse af infektion, clearing nekrotisk debris og stimulere matrix deposition. For fuldt ud at forstå de mangfoldige signalering begivenheder, der regulere denne immunrespons, det er afgørende at overholde den komplekse adfærd af (og samspil, der opstår mellem) flere celle lineages in vivo og i realtid, med høje spatio-temporal opløsning. Den optiske gennemskinnelighed og den genetiske sporbarhed af Drosophila embryoner har etableret Drosophila som en uvurderlig model til live-billede og dissekere grundlæggende aspekter af inflammatoriske celler adfærd, herunder mekanismer af udviklingsmæssige spredning, clearance af apoptotiske lig og/eller mikrobielle patogener og rekruttering til sår. Nyere arbejde har imidlertid nu vist, at ansætte et langt senere tidspunkt i Drosophila livscyklus – Drosophila puppe-tilbyder en række forskellige fordele, herunder forbedret RNAi effektivitet, længere imaging perioder, og betydeligt større immun celle numre. Her beskriver vi en protokol for billedbehandling sår reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på den høje spatio-temporal opløsning i live Drosophila pupper. For at følge dynamikken i både re epithelialization og inflammation, bruger vi en række specifikke i vivo fluorescerende markører for både epitel og medfødte immun celler. Vi har også demonstrere effektiviteten af foto-konvertible fluorophores, såsom Kaede, for efter bestemt immun celle subsets, for at spore deres adfærd, da de vandrer til, og beslutsomhed fra skaden site.
En effektiv inflammatorisk reaktion er afgørende for enhver organisme at bekæmpe infektion, rydde murbrokker og orkestrere reparation af tilskadekomne væv1. Selv om dette svar er en uundgåelig resultat af de fleste vævsskader, kræver betændelse streng regulering, fordi en uhensigtsmæssig inflammatorisk reaktion har været forbundet med en lang række forskellige menneskelige sygdomme (herunder kroniske ikke-healing sår, overdreven ardannelse og disposition til kræft)1,2,3. Denne kliniske relevans er det afgørende at opnå en mere detaljeret forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer kørsel det inflammatoriske respons for at udvikle nye prognostiske indikatorer og strategier til at behandle en række kroniske inflammatoriske betingelser, som kan beskytte reparation væv fra langvarig og unødvendige betændelse.
I de seneste år, er Drosophila blevet en veletableret og værdifulde modelsystem til at dissekere grundlæggende funktioner i det inflammatoriske respons bevaret fra insekter til menneskelige4,5. På nuværende tidspunkt Drosophila tilbyder langt større genetisk sporbarhed end det er i øjeblikket muligt i andre eksperimentelle modeller (såsom mus eller zebrafisk), muliggør præcis spatio-temporale genmanipulation i vivo (til at inaktivere eller over udtrykke nogen gen af interesse inden for specifikke celletyper for en defineret udviklingsmæssige tidspunkt) og brugervenlighed genome-wide skærme,6,7. Traditionelt, er de fleste live imaging studier af sårheling og betændelse i Drosophila blevet udført på vorden, som embryoner er immobile (i modsætning til Drosophila larver eller voksne) og optisk gennemskinnelige som muliggør enestående høj opløsning i vivo billeddannelse8. Dette har givet forskere til at visualisere den hurtige og robust rekruttering af Drosophila medfødte immun celler (hemocytes) til webstedet sår som reaktion på den mekaniske eller laser-induceret skade til embryonale epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. ved at kombinere disse live-imaging studier med genmanipulation, studier i Drosophila embryoner har afdækket mange vigtige immun celle proteiner, der styrer inflammatoriske celle behavior in vivo. For eksempel, CED-1 homolog Draper (en ITAM domæne indeholdende protein) er blevet identificeret som et vigtigt» skade receptor» der medierer rekruttering Drosophila immun celler i en H2O2-afhængige måde til steder i beskadige15. Draper niveauer inden for immunceller er igen reguleret af calcium-induceret JNK signalering og forhøjede nedstrøms apoptotiske liget optagelse12. Hemocyte motilitet yderligere kræver komplekse cytoskeletal ændringer at koordinere styret migration mod såret og dette er afhængig af aktiviteten af cytoskeletal lovgivere såsom actin-bundling protein Fascin16 og familien Rho små GTPases Rac og Rho-9.
Drosophila er en holometabolous insekt, der går gennem de ekstra larve og puppe faser efter embryogenese, før nåede voksenalderen17. Drosophila puppe er blevet udviklet som en supplerende model for non-invasiv live-imaging af en række dynamiske cellulære begivenheder, herunder udviklingsmæssige celle migration18, celledeling19, celle vækst20og muskel sammentrækning21. Mere nylig, det blev fastslået som en ny model til at studere dynamikken i såret reparation og betændelse i vivo22,23.
Ligesom i vorden er Drosophila pupper immobile og optisk gennemskinnelig, efter omhyggelig dissektion fra deres uigennemsigtig puppe tilfælde18. Ved at udnytte denne optiske gennemsigtighed, kan man følge i vivo -opførsel af medfødte immun celler (hemocytes) som reaktion på vævsskade i Drosophila puppe væv, såsom puppe fløj22. Den puppe fløj eksisterer som en simpel bilayered struktur, bestående af to store flade epitelial plader, der er tilsluttet omkring wing periferien; det ekstracellulære rum mellem disse to epitel lag er fyldt med hemolymph (insekt blod) og det store antal motile hemocytes24. Ligesom i embryoner udløser mekaniske eller laser-induceret skade wing epitel en hurtig ansættelse af hemocytes til skade site23. Men denne puppe stadie tilbyder nogle forskellige fordele for billeddannelse over tidligere vorden. Tilskadekomne pupper kan være afbildet over langt længere perioder (for mindst 5 h), mere væv område er tilgængelig for den eksperimentelle undertrykkelse af netbårne (f.eks. generation af flere sår) og der er et betydeligt større antal hemocytes til stede på dette tidspunkt ( giver mere celle baner fra længere afstande til forbedrede statistiske effekt under den matematiske analyse). Desuden, forbedret effektiviteten af RNAi-medieret genet inaktivering betydeligt i puppe stadier, tillade mange gener at være ‘slået ned’ i et væv eller time-specifik måde i forhold til de mere traditionelle hele mutant tilgang af embryoner.
For at følge dynamikken i såret re epithelialization og den ledsagende inflammatorisk respons inden for denne nye puppe model, to forskellige cellepopulationer skal mærkes: puppe epitel og de medfødte immun celler (Drosophila hemocytes). En række forskellige markører (Tabel af materialer) er tilgængelige til at mærke disse to forskellige cellepopulationer – valg af markør afhænger af de særlige proces skal undersøges. For at markere den puppe epitel, Drosophila linjer, der indeholder enten udnyttes en allestedsnærværende udtrykt normal god landbrugspraksis-tagged E-cadherin (der etiketter adherens vejkryds) rutinemæssigt for at angive positioner af cellemargener, eller alternativt en normal god landbrugspraksis-mærket Aktin-bindende domæne af Moesin (der etiketter actin cytoskeleton) til at visualisere sår-kant kontraktile actin ring og førende fremspring. At mærke Drosophila hemocytes, en hemocyte-specifikke srp-Gal425 -drev udtryk for nukleare RFP (for nukleart sporingen), cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis eller normal god landbrugspraksis-markeret Moesin (at mærke cytoplasma eller actin cytoskeleton, henholdsvis) eller en photoconvertible fluorophore (såsom Kaede) anvendes. Faktisk er det ofte fordelagtigt at bruge flere immun celle markører i kombination, aktivere simultan analyse af den nukleare bevægelse og celle morfologi (Se repræsentative resultater). Men da denne protokol indebærer anvendelse af Drosophila pupper, kun kombinationer af genetiske markører som er levedygtige indtil midten af puppe faser kan udnyttes. Også, embryonale dødbringende bestande vil ikke være egnet. Det er usandsynligt, at være et problem, når imaging kontrol (eller wild-type) pupper men er vigtigt at overveje, når gener er at blive slået eller overexpressed, for at vurdere deres effekt på såret lukning eller betændelse. I tilfælde af tidlig dødelighed forårsaget af genet knockdown (eller overekspression), en Gal80ts konstruktion kan bruges til at fremkalde den Gal4-drevet knockdown senere i udvikling (Se diskussion).
I vores nyere undersøgelser, er flytter ind i den puppe stadie lykkedes os at samle tilstrækkelige immun celle bane data til at analysere inflammatoriske adfærd ved hjælp af avanceret matematisk modellering, som igen har tilladt os at udlede roman detaljer af sår inflammatorisk attractant signaler23. For eksempel viste denne tilgang at såret chemoattractant breder sig langsomt gennem det betændte væv på 200 μm2/min, et langt langsommere end tidligere foreslået lille kandidat molekyler såsom ATP sats eller H2O2 indberettes til diffuse26,27,28,29; disse små “skader” molekyler forventes i stedet at fungere som eftergivende signaler. Derudover ved at følge de langsigtede adfærd i medfødte immun celler, som de løse fra et indledende sår og udsættes for en anden (lavet på forskellige timepoints efter først), har vi afdækket en midlertidig ‘desensibilisering’ periode, hvilke immunceller er blinde for efterfølgende skader23. Ved at udnytte den puppe model, sammen med Drosophilas genetiske sporbarhed langsigtede imaging potentiale, kan man følge funktionsmåden for bestemt immun cellepopulationer (f.eks. kun de immunceller rekrutteret til webstedet sår) i svar til efterfølgende fornærmelser, ved hjælp af photoconvertible fluorophore30 som kan udtrykkes udelukkende inden for immun celle lineage23.
Her beskriver vi en protokol for at visualisere dynamikken i såret reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på høj spatio-temporal opløsning ved hjælp af levende Drosophila pupper. Vi giver en detaljeret metode til at dække de trin, der kræves til den indledende pupper forberedelse (dissektion og montering) og den efterfølgende laser-medieret kvæstelse og time-lapse imaging. Vi beskriver også brug af foto-cabriolet fluorophores at tillade mærkning af bestemt immun celle subsets i vivo. I den langsigtede forestiller vi at denne nye Drosophila puppe model åbner spændende muligheder for dissekere komplekse signaling dynamikken bag den inflammatoriske reaktion på vævsskade. Ved at anvende mere avancerede statistiske analyser kan man afdække funktioner af de svar, der ellers ville forblive eksperimentelt utilgængelige, mens RNAi effektivisering kunne egner sig til anvendelsen af genome-wide screening inden for immunceller i vivo til at identificere nye spillere regulering immun celle adfærd.
Akut inflammatorisk reaktion på vævsskade er en kompleks og yderst dynamisk proces, der er afgørende for at orkestrere reparation af tilskadekomne væv, herunder clearance af nekrotisk snavs og til at bekæmpe infektion. For fuldt ud at forstå og optrævle grundlæggende aspekter af dette svar, er det afgørende, at undersøgelser er udført i vivo på 3-dimensionelle levende prøver i orden nemlig den præcise opførsel og samspillet mellem de forskellige celle lineages involveret skal følges præcist over tid. Real-time analyse af disse celle dynamics giver mulighed for en mere detaljeret karakterisering af mutant fænotyper end statisk enkelt tid-point fra faste prøver ved hjælp af klassisk Immunhistokemi teknikker. Traditionelt har brugt de fleste live imaging undersøgelser ved hjælp af genetisk tractable Drosophila model fruitfly embryonale udviklingstrin på grund af sine optiske gennemskinnelighed og ubevægelighed i forhold til den senere udviklingsstadier4 , 5. men mere for nylig vores gruppe og andre har udviklet Drosophila puppe som en roman model til at udføre høj opløsning og langsigtede imaging sår og betændelse samtidigt i vivo8,22 ,23. Denne nye tilgang tilbyder en spændende langsigtede potentiale for unraveling grundlæggende aspekter af den inflammatoriske celle adfærd og kan tilpasses yderligere for at undersøge den dynamiske opførsel af andre celle lineages (såsom Drosophila adipocytter 38) efter vævsskade.
Der er en række kritiske faktorer under forberedelse og billeddannelse af sårede Drosophila pupper, der afgør kvaliteten af imaging resultaterne beskrevet ovenfor. Velsagtens er det mest vanskelige skridt af den beskrevne protokol omhyggelig dissektion og præcis positionering af pupper inden såret og billedbehandling. Pupper på denne udviklingsstadiet er ekstremt skrøbelige og selv mindre utilsigtet skade på pupper under forberedelse faser vil væsentligt forringer eksperimentet; enhver pupper, der kan have fået utilsigtede skader skal kasseres fra forsøget, da denne skade kunne aktivere sin egen inflammatorisk reaktion, som kunne føre til mere udbredt (eller endda systemisk) effekter på inflammatoriske celle opførsel andre steder i puppe. På grund af den igangværende udvikling af pupper udnyttes i disse eksperimenter (som undergår betydelige væv rearrangementer for at forberede voksenalderen væv), lejlighedsvis pupper vil flytte i løbet af billedbehandling. Puppe rullende er, dog, mere tilbøjelige til at opstå, hvis pupper ikke har været monteret korrekt med den fladeste overfladen af fløjen (eller andre væv til afbildning) i den direkte kontakt med daekglas; Brug af heptan lim. til at stabilisere pupper på dækslet glas bør minimere denne uønskede bevægelse. Af denne grund, skal stor omhu også taget at undgå løs pupper fra deres nøje justerede positioner, når du flytter prøverne mellem mikroskoper; ideelt, såret laser vil blive knyttet til den samme mikroskop bruges til efterfølgende time-lapse imaging og foto-konvertering.
Ud over præstationsprøvninger af puppe dissektion og montering trin, vil Drosophila pupper bruges præcise genotype har en betydelig indvirkning på kvaliteten af de billeddiagnostiske data genereret. For eksempel, afgør antallet af kopier af Gal4 driver og UAS konstruktioner (f.eks. UAS-normal god landbrugspraksis eller UAS-Kaede) inden for en individuel puppe genotype signal til støjforhold under efterfølgende billeddannelse. Som en generel regel, de flere kopier af et Gal4 eller UAS konstruere øjeblikket, jo større det samlede niveau af fluorescerende proteiner (f.eks. normal god landbrugspraksis eller Kaede) inden for væv. Det optimale niveau af fluorescerende proteiner bliver dog en omhyggelig balance mellem opløftende væv fluorescens tilstrækkeligt til at give høj kvalitet billeddannelse (brug af lavere laser beføjelser, reduktion af photobleaching aktiveres og imaging over længere tid perioder), men uden at forårsage fluorophore-induceret cellulære toksicitet; det optimale antal Gal4 og UAS konstruktioner i hvert forsøg vil variere alt efter de særlige drivere og fluorophores bliver brugt. Bør sikres at hæve pupper ved 25 ° C (eller over op til 29 ° C), fordi Gal4-UAS system er temperatur følsom og vil være ineffektivt på lavere temperaturer31. For at opnå yderligere niveauer af kontrol over væv eller tid-specificiteten af Gal4 –drevet udtryk, kan Gal4-UAS system repressor Gal80 også inkluderes i puppe genotype39. Gal80 kan enten bruges til at undertrykke Gal4 aktivitet inden for en bestemt væv (ved hjælp af en væv-specifik Gal80) eller på et bestemt tidspunkt (ved hjælp af en temperatur følsom Gal80). Gal4-UAS system kan yderligere kombineres med andre uafhængige binære systemer (såsom LexA –lexAop og QF –QUAS systemer) til at generere Drosophila som har flere konstruktioner (f.eks. fluorophores, RNAi linjer eller andre genetiske konstruktioner) samtidig til udtryk i en række forskellige væv39.
Brug af denne nye Drosophila puppe model tilbyder en række fordele i forhold til de mere traditionelle embryo tilgang. I forhold til de kortsigtede imaging (op til 3 h) tilgængelig i fase 15 embryoner (fase hvor mest embryonale såret undersøgelser udføres), pupper kan være afbildet over betydeligt længere perioder (i princippet indtil voksenalderen efter 96 timer puppe udvikling ). Desuden langt større antal hemocytes (Drosophila medfødte immun celler) er stede i puppe væv (og tilgængelige for imaging) sammenlignet med mere begrænset antallet stede i fosteret og dette har tilladt os at samle betydeligt mere billeddiagnostiske data på hemocyte adfærd ved hjælp af den samme samlede antal enheder. Afgørende, har dette, til gengæld aktiveret os til at anvende mere avancerede matematiske modellering for at analysere hemocytes adfærd og udtrække roman egenskaber såret attraktanter og inflammatoriske respons, der ellers ville forblevet eksperimentelt utilgængelige23. En anden fordel ved den puppe model er, at RNAi-medieret gen knockdown er betydeligt mere effektivt end på tidligere embryonale stadier, giver forbedret analyse af væv eller time-specifik genet inaktivering ved hjælp af binære systemer såsom Gal4-UAS system 39. effektiviteten af RNAi på nuværende tidspunkt således åbner mulighed for at udføre store skala (eller endda upartiske genome-wide) RNAi skærme for at søge efter nye aktører i enten sår reparation eller inflammatorisk celle adfærd.
Dog Drosophila pupper klart kan ikke bruges til at studere fænotyper som følge af genetiske mutationer, som er embryonale dødbringende; funktionel og live imaging studier af gener, der er afgørende for embryonale udvikling skal derfor stadig udføres i embryoner, medmindre RNAi-medieret gen knockdown i en tid eller væv-specifik måde tillader udvikling at opstå gennem puppe faser. Fosteret er også fortsat model valg at studere og live-billede visse funktioner af immun celle adfærd, herunder udviklingsmæssige spredningen af immunceller fra deres oprindelse, kontakt-inhibering af bevægelse og fagocytose af apoptotiske lig genereret under udviklingsmæssige væv sculpting5,8 , som endnu ikke er blevet overholdt i puppe modeller. Selv om undersøgelser i Drosophila larver og voksne har givet et vigtigt indblik i mekanismerne bag såret reparation og betændelse40,41,42,43, 44 live imaging undersøgelser på disse stadier har vist sig vanskeligt på grund af prøverne, der i sagens natur mobil karakter. Medens larverne kan være bedøvede tillade korte perioder af live-imaging, på grund af den midlertidige karakter af anæstesi, kun korte snapshots af levende såret reparere eller inflammatoriske respons kan være visualiseret45. En nylig undersøgelse har nu udviklet en forbedret protokol, der tillader mere langsigtede billeddannelse af larve sårheling46, selv udarbejdelse og imaging stadig forblive betydeligt mere udfordrende end i embryoner eller pupper. I den langsigtede forestiller vi at ved at udnytte den mest hensigtsmæssige udviklingsstadiet for at løse hver specifikke spørgsmål, undersøgelser i alle fire af disse forskellige Drosophila faser – fra embryoner gennem larve og puppe perioder til voksenalderen (hver med deres egen unikke fordele og begrænsninger) – vil give supplerende indsigt i de molekylære og cellulære mekanisme kørsel sår reparation og betændelse.
Fremover vil denne protokol for sårede og langsigtede billeddannelse af Drosophila pupper nemt kan tilpasses til at studere en række betændelse-relaterede fænomener og har vidtgående muligheder for at afdække nye funktioner af inflammatoriske sår svar. Kombinationen af langsigtede imaging, sammen med anvendelse af photoconvertible fluorophores (såsom Kaede), er af stor værdi for at forstå dynamikken i medfødte immun celle adfærd og navnlig den langt mindre forstået opløsning fase af såret inflammatorisk respons. Ved specielt mærkning enten individet eller delpopulationer af immunceller (f.eks. ansatte på et sår) vil det være muligt at analysere hvordan eksponering for en miljømæssig cue (f.eks. en liget eller skade) påvirker den immun celle efterfølgende svar på et senere cue. Drosophila hemocytes provokerende adfærd kan ændres af tidligere erfaringer – for eksempel, de er klar til at reagere på vævsskade af forudgående fagocytose af apoptotiske lig under udvikling12 men det er stadig uvist om andre miljømæssige stikord fremkalde lignende priming begivenheder. Selv om undersøgelser af puppe sår hidtil har fokuseret på de medfødte inflammatorisk respons, puppe wing model også giver en ideel mulighed for at både live-billede og dissekere de underliggende epitelial sår reparation mekanismer. Desuden kunne dette puppe billedmetoden også tilpasses for at undersøge den dynamiske opførsel af andre celle lineages i svar til væv skader38, enten i den puppe fløj, sig selv eller andre lettilgængelige puppe væv (såsom øjne, ben eller thorax). Endelig, ved at kombinere den genetiske sporbarhed af Drosophila sammen med lethed af langsigtede puppe imaging, Roman epitelial reparation eller inflammatorisk tilsynsmyndigheder kunne være afdækket gennem anvendelse af uvildige genome-wide knock-down tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af Martin, Nobes, Richardson og træ labs for nyttig diskussion. Vi takker også Wolfson Bioimaging facilitet (University of Bristol, UK), Bloomington Stock centrum (Universitet i Indiana, USA) og Vienna Drosophila Resource Centre (for Drosophila bestande) og Flybase (for op til dato Drosophila gen annotation). Dette arbejde blev støttet af en MRC Project Grant til P.M. og WW (hr./J002577/1), en Wellcome Trust Senior stipendium til WW og en Wellcome Trust Investigator Award til kl.
Drosophila stocks | |||
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation and mounting | |||
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser ablation and imaging | |||
Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Image Analysis Software | |||
FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |