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Ambiente

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Published: July 16, 2018
doi:
10.3791/57876
, , ,
1Department of Entomology,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture,University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Fungizid-Sprays auf Blütenpflanzen können solitäre Bienen gegenüber hohen Konzentrationen von Pollen getragen Fungizid Rückstände aussetzen. Mit Labor-basierten Experimente mit in-Vitro-gezüchteten Bienenlarven, diese Studie untersucht die Wechselwirkungen des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen aus Host und nicht-Host Pflanzen gewonnen.

Abstract

Obwohl Solitärbienen entscheidend Bestäubung wild und verwalteten Kulturen erbringen, hat dieser artenreichen Gruppe weitgehend in Schädlingsbekämpfungsmitteln Verordnung Studien übersehen worden. Das Risiko einer Exposition gegenüber Fungizid Rückstände ist wahrscheinlich zu hoch sein, insbesondere wenn das Spray auf oder in der Nähe von Wirtspflanzen auftritt, während die Bienen sammeln Pollen ihre Nester bereitstellen. Arten von Osmia , die Pollen von einer ausgewählten Gruppe von Pflanzen (Oligolecty) zu konsumieren, kann die Unfähigkeit zur Nutzung der Pollen von nicht-Wirtspflanzen ihre Risikofaktor für Fungizid-bezogene Toxizität erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt Protokolle verwendet, monophyletische Mauerbienen, Osmia Ribifloris Sensu Lato, vom Ei bis zum prepupal Stadium in Kultur Zellplatten unter standardisierten Laborbedingungen erfolgreich aufzuziehen. Die in-Vitro-gezüchteten Bienen werden anschließend verwendet, um Belichtung und Pollen Quelle Fungizid auf Biene Fitness auswirkt. Basierend auf einem 2 × 2 vollständig gekreuzt faktoriellen Design, untersucht das Experiment die Haupt- und interaktive Auswirkungen von Fungizid Exposition und Pollen Quelle an Larven Fitness, durch prepupal Biomasse, Larvale Entwicklungszeit und Survivorship quantifiziert. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen natürlichen Hintergrund Variabilität reduziert und ermöglicht die gleichzeitige Manipulation von mehreren experimentellen Parameter. Das beschriebene Protokoll präsentiert ein vielseitiges Werkzeug für Hypothesen Tests, an denen die Suite von Faktoren, die Gesundheit der Bienen. Für Erhaltung Bemühungen mit erheblichen und dauerhaften Erfolg erfüllt werden werden solche Einblicke in das komplexe Zusammenspiel von physiologischen und ökologischen Faktoren, die Biene Rückgänge erweisen sich als kritisch.

Introduction

Angesichts ihrer Rolle als die dominierende Gruppe von Bestäubern1, stellt der weltweite Rückgang der Bienenvölker eine Bedrohung für Ernährungssicherheit und Ökosystem Stabilität2,3,4,5,6 ,7. Die rückläufigen Trends in beiden verwaltet und wilde Bienenvölker werden mehrere gemeinsame Risikofaktoren einschließlich Habitatfragmentierung, neue Parasiten und Krankheitserreger, Verlust der genetischen Vielfalt und die Einführung invasiver Arten3 zugeschrieben ,4,7,8,9,10,11,12. Insbesondere ist der dramatische Anstieg der Verwendung von Pestiziden, (z. B. Neonicotinoide) direkt zu negativen Auswirkungen bei den Bienen13,14,15verbunden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Synergismus zwischen Neonicotinoide und Ergosterol-Biosynthese-Hemmung (EBI) Fungizide über mehrere Biene Arten16,17,18 , hohe Mortalität führen kann , 19 , 20 , 21 , 22. dennoch Fungizide, lange Zeit als “Biene-Safe”, weiterhin auf-Blüte ernten ohne viel Kontrolle23gesprüht werden. Sammlerbienen sind dokumentiert worden, um routinemäßig wieder Pollen Lasten mit Fungizid Rückstände24,25,26kontaminiert. Der Verzehr von solchen Fungizid-Ladenpollen kann dazu führen, dass hohe Mortalität unter larval Bienen27,28,29,30und eine Palette subletale Effekte unter Erwachsenen Bienen16 , 31 , 32 , 33 , 34. eine aktuelle Studie legt nahe, dass Fungizide Biene Verluste verursachen, durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft im Bienenstock gespeichert Pollen, dabei stören die kritische Symbiosen zwischen Bienen und Pollen-borne Mikroben35.

Obwohl solitäre Bienen für die Bestäubung von mehreren wild und landwirtschaftliche Pflanzen36,37,von entscheidender Bedeutung sind hat38, diese heterogene Gruppe der Bestäuber in Pestizid Überwachung Studien viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Das Nest einer erwachsenfrau einsame enthält ca. 5-10 versiegelte Brut Kammern, jeweils bestückt mit einer endlichen Masse von mütterlich gesammelten Pollen und Nektar und ein einzelnes Ei-39. Nach dem Schlüpfen verlassen die Larven auf die zugewiesenen Pollen-Bereitstellung und die zugeordneten Pollen getragen Mikrobiota, angemessene Ernährung40,41zu erhalten. Weil sie die Vorteile eines sozialen Lebensstils fehlt, möglicherweise solitäre Bienen anfälliger für Pestizid Exposition42. Zum Beispiel während der Defizite im sozialen Bienen nach einem Spray kompensiert werden kann einige verlängern von Arbeitern und neu entstehende Brut, der Tod eines einzigen einsamen erwachsenfrau endet alle Vermehrungstätigkeit43. Solche Unterschiede in der Empfindlichkeit unterstreichen die Notwendigkeit, diverse Biene Taxa in Ökotoxikologische Untersuchungen ausreichend Schutz für verwaltete und wilde Bienen gleichermaßen zu integrieren. Aber abgesehen von einer Handvoll Studien, Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizid-Exposition in erster Linie konzentriert sich auf soziale Bienen18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Solitäre Bienen gehören zur Gattung Osmia (Abbildung 1) sind weltweit als effiziente Bestäuber mehrere wichtige Obst-und Nuss Pflanzen39,50,51,53, benutzt worden 53. Gruppen mit anderen verwalteten Bestäuber24,54,55,56,57,58, Osmia Bienen sind routinemäßig Fungizide in voller Blüte ernten44aufgesprüht ausgesetzt. Adulte Weibchen auf Nahrungssuche auf vor kurzem gespritzten Pflanzen sammeln und lagern ihre Brut Kammern mit Fungizid-beladenen Pollen, die später die alleinige Ernährung für die entwickelnden Larven bildet. Verzehr von kontaminierten Pollen Bestimmungen kann anschließend die Larven zu Fungizid Rückstände42verfügbar. Das Risiko eines möglicherweise höhere unter monophyletische Arten, die nur auf wenige eng verwandte Host Pflanzen59,60,61Futter. Zum Beispiel scheinen bestimmte Megachilid Bienen, bevorzugt für minderwertige Asteraceae Pollen, als ein Mittel zur Verringerung von Parasitismus62Futter. Jedoch wurde das Ausmaß auf dem Fungizide Larven Fitness unter monophyletische solitäre Bienen auswirken empirisch nicht quantifiziert. Das Ziel dieser Studie ist es, ein Protokoll, um die wichtigsten test entwickeln und interaktive Effekte von Fungizid Exposition und Pollen Quelle auf die Fitness der in-vitro- aufgezogen Solitärbienen. Um zu untersuchen, können Eier von O. Ribifloris Sensu Lato (s.l.) im Handel bezogen werden (Table of Materials). Diese Population eignet sich wegen seiner Bedeutung als eine native Bestäuber und seine starke Vorliebe für die nektarreichen Mahonia Aquifolium (Mahonie) gefunden in der Region53,63,64 (Abbildung 2).

Figure 1
Abbildung 1: Ein hochauflösendes Foto von einem Erwachsenen Osmia Ribifloris. Photo credit Dr. Jim Cane, Forschung Entomologe, USDA-ARS Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Phragmite nisten Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.) mit einem brütenden Weibchen im Vordergrund. Kammer-Partitionen und Klemme Stecker für die Stimmzungen sind aus vorgekaute Blättern gefertigt. Bildnachweis: Herr Kimball Clark, NativeBees.com Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Das erste Ziel dieser Studie ist die Wirkung des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen auf Larven Fitness (gemessen an der Entwicklungszeit und prepupal Biomasse) bewerten. Während der Exposition gegenüber der allgemein angewandten Fungizid-propiconazolhaltige mit erhöhter Mortalität unter Erwachsenen Bienen über mehrere Arten 23,24,32,44,45, verbunden worden ist 54,55,56,57,58,65,66,67, ihre Auswirkungen auf die larval Bienen ist weniger bekannt. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Bewertung der Auswirkungen des Konsums von nicht-Host Pollen auf Larven Fitness. Bisherige Studien zeigen, dass Larven der monophyletische Bienen nicht weiterentwickeln, wenn gezwungen, nicht-Host Pollen68verbrauchen. Solche Ergebnisse können Schwankungen der Biene Physiologie69, Pollen Biochemie70und die wohltuende Microbiome verbunden mit natürlichen Pollen Bestimmungen71zugeschrieben werden. Das dritte Ziel dieser Studie ist es, die interaktiven Effekte der Fungizidbehandlung und diätetische Pollen auf Larven Fitness zu bewerten.

Zahlreiche biologische Merkmale, einschließlich mütterlichen Körpergröße, sind Bereitstellung Rate, Futtersuche Strategie und Pollen Menge72,73,74,75 bekannt, larval Fitness unter solitäre Bienen beeinflussen. Diese Faktoren können erhebliche Variabilität zwischen Schilf, die eine Herausforderung vertretbar experimentellen Designs zu entwickeln, bei der Beurteilung der Larven Gesundheit darstellt einführen. Darüber hinaus da die Larvalentwicklung in versiegelten Verschachtelung Schilf auftritt, sind der Auswirkungen von solchen Variabilität auf die Nachkommen schwierig zu visualisieren und quantifizierte ohne Verwendung von nicht-tödlichen Techniken (Abbildung 3). Um diese Herausforderung zu meistern, sind alle Hypothesen im Rahmen dieser Studie mit Larven aufgezogen außerhalb ihre Verschachtelung Schilf getestet. Das experimentelle Design stellt eine vollständig gekreuzte 2 × 2 Faktorielle Set-ups, mit jeder Faktor bestehend aus 2 Ebenen; Faktor 1: Fungizid Exposition (Fungizid; Kein Fungizid); Faktor 2: Pollen Quelle (Host Pollen, Non-Host Pollen). Bienen werden aus dem Ei in die prepupal Phase im sterilen multiwell Kultur Zellplatten unter kontrollierten Laborbedingungen ausgelöst. Jeder ist gut individuell bestückt mit einer standardisierten Menge Blütenstaub und ein einziges Ei. Nach dem Schlupf der Larve ernährt sich von den zugewiesenen Pollen in den Brunnen, vervollständigt Larvalentwicklung und Verpuppung initiiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass unerklärliche Sterblichkeit bei den Bienen innerhalb dieser künstliche Aufzucht Umgebung als in die wilde49,76aufgetretenen geringer ist. Die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen hat mehrere Vorteile gegenüber feldbasierte Untersuchungen: 1) es minimiert die verwirrende Wirkung der natürlichen Variabilität und unkontrollierte Faktoren, die in der Regel mit Feld-Studien; (2) Es kann mehrere Ebenen von Manipulation für jedes Risiko von Interesse über Behandlungsgruppen gleichzeitig getestet werden; (3) die Anzahl der Wiederholungen kann vorgegeben werden, und experimentelle Faktoren für jede replizieren können individuell bearbeitet werden; (4) Larven Antwortvariablen problemlos visualisiert und unabhängig ohne störende neben Larven aufgenommen; (5) das Protokoll kann geändert werden, um komplexere experimentellen Designs mit mehreren Faktoren und Zielgrößen zu berücksichtigen.

Figure 3
Abbildung 3. Inhalte in eine natürliche Nistplätze Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.). Nahaufnahme von (A) ein seziert Schilfrohr mit einzelnen Kammern, Pollen Bestimmungen und Partitionen, und (B) frisch Pollen Bestimmungen und die damit verbundenen Eier (gekennzeichnet mit einem schwarzen Kreis) geerntet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. bereiten Sie Propiconazolhaltige Lösungen für Fungizid Belichtung Experimente Bereiten Sie 0,1 x Fungizid-Lösung durch entsprechende Mengen von im Handel erworbenen propiconazolhaltige 14,3 % in sterilem Wasser am Tag des Experiments auflösen. Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereitete Fungizid-Lösung für alle Anwendungen verwendet wird. Fügen Sie 23 µL 0.1 x Fungizid-Lösung pro Gramm Pollen Bestimmung, die maximale Konzentration des propiconazolhaltige bereits berichtet von Bienen ge…

Representative Results

Larval Fitness wurde mit drei Metriken (i) Larvale Entwicklungszeit, (Ii) prepupal Biomasse und (Iii) Prozent Survivorship quantifiziert. Eine zwei-Wege-ANOVA wurde mit Fungizid Exposition durchgeführt (zwei Ebenen: kein Fungizid, Fungizid) und Pollen Quelle (zwei Ebenen: Host Pollen, Non-Host Pollen) als die unabhängigen Variablen und Larvale Entwicklungszeit als abhängige Variable. Der Haupteffekt für Fungizid Exposition (F1,28 = 1.24, P = 0,28) war nich…

Discussion

Aufzucht von Bienen außerhalb ihrer natürlichen Verschachtelung Schilf unter Laborbedingungen ermöglicht die Prüfung von mehreren Hypothesen, die im Zusammenhang mit Larven Fitness. In dem Maße, in dem nicht identifizierte Faktoren weiterhin Bienensterben führen, riskieren Studien können in-vitro- Experimente mit Hilfe identifizieren möglicher Bedrohungen und Management-Praktiken zu informieren, für diese artenreichen Gruppe der wilden Bestäuber 12 ,<sup class="xref"…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Kimball Clark und Tim Krogh für die Bereitstellung von Osmia Verschachtelung Schilf, Meredith Nesbitt und Molly Bidwell für Hilfe im Labor, DRS. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter und drei anonymen Gutachtern für Ihre nützliche Kommentare, die das Manuskript verbessert. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Ministerium für Landwirtschaft, Handel und Verbraucherschutz (#197199), National Science Foundation (unter unterstützt. Grant Nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0
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Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).
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