Protokollen præsenteret her tillader reproduktion af en udbredt grå stof demyelination af begge kortikale halvkugler i voksne mandlige Dark Agouti rotter. Metoden består af intracerebral implantation af et kateter, subklinisk immunisering mod myelin oligodendrocyt glycoprotein og intracerebral injektion af en proinflammatorisk cytokinblanding gennem det implanterede kateter.
Multipel sklerose (MS) er den mest almindelige immunmedierede sygdom i centralnervesystemet (CNS) og fører gradvist til fysisk handicap og død, forårsaget af hvide stoflæsioner i rygmarven og lillehjernen samt ved afmyelinering i gråt stof. Mens konventionelle modeller af eksperimentel allergisk encephalomyelitis er egnede til undersøgelse af cellemedieret betændelse i spinal og cerebellar hvidt stof, undlader de at adressere grå stofpatologier. Her præsenterer vi forsøgsprotokollen for en ny rottemodel af kortikal demyelinering, der gør det muligt at undersøge de patologiske og molekylære mekanismer, der fører til kortikale læsioner. Afmyelinationen fremkaldes af en immunisering med lavdosis myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) i en ufuldstændig Freunds adjuvans efterfulgt af et kateter-medieret intracerebral levering af proinflammatoriske cytokiner. Kateteret muliggør desuden flere runder af demyelination uden at forårsage injektionsinduceret traume samt intracerebral levering af potentielle terapeutiske lægemidler, der gennemgår en præklinisk undersøgelse. Metoden er også etisk gunstig som dyrs smerte og angst eller handicap er kontrolleret og relativt minimal. Den forventede tidsramme for gennemførelsen af hele protokollen er omkring 8 – 10 uger.
MS er en immunmedieret, inflammatorisk sygdom i CNS, som primært skader myelinplader, men i sidste ende fører til axonal tab og permanent neuronal skade. MS er den mest almindelige immunmedierede sygdom i CNS med en anslået prævalens på omkring 2,3 millioner mennesker på verdensplan, ifølge National MS Society1, og udgør en stor personlig og socioøkonomisk byrde. Den gennemsnitlige alder af sygdommen debut er 30 år og fører til tab af produktive år ved at forårsage alvorlige handicap. MS er i øjeblikket uhelbredelig, og de nuværende behandlingsmetoder har til formål at håndtere symptomerne under et akut tilbagefald i relapserende remitterende MS og at ændre sygdomsforløbet for at reducere tilbagefaldsfrekvensen ved immunmodulatorisk behandling2,3. Ingen behandlingsmulighed har endnu vist sig effektiv for de progressive type4, med undtagelse af et nyligt klinisk forsøg med B-celle nedbrydende behandling, som viste sig at være effektiv i en undergruppe af primære progressive MS (PPMS) patienter med aktivinflammation 5. Selv om der er identificeret flere potentielle genetiske6- og miljørisikofaktorer7, er MS’s ætiologi dog stadig ukendt.
MS er kendetegnet ved store inflammatoriske demyelinerende plaques i, og diffuse skader på det hvide stof8,9. Focal læsioner har været forbundet med en omfattende T-celle medieret angreb, oligodendrocyt ødelæggelse, reaktiv astrogliose, og axonal degeneration, der fører til en motor neuron tilbagegang. Grå stof afmyelination og atrofi har fået anerkendelse som yderligere histopatologiske træk ved sygdommen9,10,11. Sidstnævnte er blevet foreslået at bidrage til den neurologiske dysfunktion og kognitiv tilbagegang hos patienter12,13. Der er skelnet mellem tre mønstre af kortikal demyelination, nemlig i) leukocortical, sammenhængende med de hvide stoflæsioner (34%), ii) små, perivaskulære (16%) og iii) subpial (50%). I modsætning til fokale hvide stoflæsioner er disse grå stoflæsioner blevet rapporteret at mangle et T-celle medieret angreb og er i stedet karakteriseret ved en forbedret mikroglial aktivering, apoptose og neuronalt tab12.
Hidtil har det ikke været muligt at sammenfatte humane MS i en enkelt dyremodel, hovedsagelig på grund af sygdommens kompleksitet. En række MS dyremodeller, der hver simulerer forskellige aspekter af sygdompatogenese og progression, er i stedet blevet udviklet14,15. Nuværende dyremodeller efterligner tre forskellige sygdomsprocesser: i) fokale inflammatoriske læsioner, ii) diffus skade på hvidt stof og iii) diffus patologi af gråt stof.
Dyreforsøg af MS hvide stof plaques er for det meste blevet udført i gnaver encephalomyelitis (EAE) modeller. Forsøgsdyr er aktivt immuniseret med en emulsion, der indeholder en myelin antigen [normalt myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG)16,17, myelin grundlæggende protein (MBP)18, eller proteolipid protein (PLP)19], sammen med en komplet Freund’s adjuvans (CFA)20. Sygdommen kan også passivt induceres ved en adoptivoverførsel af myelinspecifikke T-celler21. Sygdomsforløbet afhænger af den kombination af antigen/musestamme, der anvendes. MOG35-55 i C57BL/6, for eksempel, resulterer i en monofasisk kronisk sygdom22, mens PLP139-151 i schweiziske Jim Lambert (SJL) mus fører til et tilbagefald-remitterende sygdomsforløb23 på en kønsspecifik måde24. Rotte MOG35-55, yderligere,fremkalder en encephalitogen T-celle respons, mens human MOG35-55 inducerer B-celle-afhængig inflammation i C57BL/6 mus25. Forskellige EAE-modeller giver et fremragende værktøj til at studere cellemedieret betændelse primært i rygmarven og cerebellum, men forhjernstrukturer som cortex, corpus callosum og subkortikale strukturer forbliver stort set skånet26. Hverken diffus skade på hvidt stof eller afmysorering af gråt stof er desuden tilstrækkeligt gentaget i EAE-modellerne26,27. Kortikal afmyelinering i forbindelse med aktiv EAE-induktion er blevet rapporteret i marmosets28,29 og i visse Lewis rotteunderstammer, i sidstnævnte tilfælde tilskrives de fremherskende kombinationer af MHC-klasse I og klasse II-isotyper og alleler30.
Den cuprizone model31 er et nyttigt redskab til at studere diffust hvidt stof demyelination og grå stof patologi med en omfattende demyelination af kortikale, sub-kortikale32, og hippocampal33 regioner, samt corpus callosum34 og kaudale putamen35. Cuprizone forgiftning, som i princippet resulterer i metabolisk stress-induceret apoptose af oligodendrocytter, efterligner nogle egenskaber ved kortikale demyelinerende læsioner af MS hjerner såsom en mikroglia aktivering, astrogliose, og en relativ mangel på infiltrere perifere immunceller. Manglen på neuronal apoptose og thalamic atrofi, samt den komplette opløsning af demyelination med en robust remyelination observeret ved ophør af kosten cuprizone tilskud32, dog begrænse cuprizone forgiftning brug som en præklinisk MS model. Giftig afmyelinering kan også fremkaldes ved en fokal injektion af lysolecithin eller ethidiumbromid i de hvide stofkanaler36,37, men disse metoder anvendes sjældent. Giftige demyelinationsmodeller er særligt velegnede til analyse af de komplekse remyelinationsmekanismer, såsom kravet om oligodendrocyt stamceller og astrocytter38,39. Detaljerede oplysninger om EAE og forgiftningsmodeller findes i to nylige gennemgange15,40.
Den cytokin-inducerede demyelination blev oprindeligt udviklet til at studere spinal hvide stoflæsioner i EAE41. Senere blev det modificeret til at studere kortikale grå stof patologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis rotter er først primet af en sub-klinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ufuldstændig Freund’s adjuvans (IFA). I modsætning til klassiske EAE-modeller udviser disse primede dyr ikke kliniske symptomer på fokale inflammatoriske læsioner i rygmarven. I stedet opnås en inflammatorisk respons og demyelination i hjernen efterfølgende ved en intracerebral administration af en proinflammatorisk cytokinblanding [tumornekrosefaktor alpha (TNFα) og interferon gamma (IFNγ)], når dyrene har opnået en stabil titer af anti-MOG antistoffer i blodet.
Undersøgelser af Merkler et al. 42 og Gardner m.fl. 44 har bevist effekten af en subpiel kortikal demyelinationsinduktion ved hjælp af en subklinisk MOG-immunisering og en intracerebral eller subarachnoidal cytokininindsprøjtning. Den rapporterede varighed af afmyelineringen var imidlertid for kort en fuldstændig remyelination i 14 dage eller mindre, hvilket begrænsede vinduet for enhver farmakologisk intervention test. Begge modeller, desuden udnytte en traumatisk injektion modus, som i sig selv kan forårsage en injektion traumer og en blod-hjerne barriere (BBB) sammenbrud og dermed føre til en ukontrolleret rekruttering af inflammatoriske celler i parenchyma. Begge undersøgelser viste desuden afmyelination, der er begrænset til et begrænset område, i ipsilateral cortex eller i nærheden af stedet for cytokininjektionen.
For at overvinde disse begrænsninger implanterede vi et kateter i højre parietal cortex af DA rotter, med kateterspidsen placeret lige over corpus callosum. For at muliggøre en fuld genopretning af BBB-integriteten fik dyrene en hvileperiode på 2 uger efter kateterets implantation. Derefter blev rotterne sub-klinisk immuniseret med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Efter opnåelsen af en stabil anti-MOG antistoftitre efter ca. 4 uger blev 2 μL cytokinblanding injiceret via kateteret inden for 10 minutter ved hjælp af en programmerbar sprøjtepumpe. Denne procedure fremkaldte en udbredt kortikal demyelination af både ipsi- og kontralaterale hjernehalvdele på 15 dage med en delvis remyelinering omkring 30 dage efter cytokinindsprøjtningen43. Flere demyelinationsfaser kunne desuden fremkaldes ved gentagen indgift af proinflammatoriske cytokiner gennem kateteret, og global hjerneatrofi, et fælles træk ved progressive MS-undertyper45, kunne induceres så tidligt som efter den anden demyelinationsfase43. Det er vigtigt, at det implanterede kateter også kan bruges til at teste farmakologiske indgreb.
Nedenstående protokol giver en detaljeret forklaring af de eksperimentelle trin for en reproducerbar generation af udbredt kortikal demyelination på begge hjernehalvdele af DA-rotter ved hjælp af et intracerebralkateter.
Vores metode bruger DA rotter. Tilpasningen til mus vil sandsynligvis kræve brug af et mindre kateter og skruer. Det skal også tages i betragtning, at sygdomsforløbet, den inflammatoriske reaktion og omfanget af afmyelinering kan afvige fra det, der præsenteres her, hvis der anvendes en anden art / stamme. Sådanne forskelle er blevet observeret med klassiske EAE-modeller ved hjælp af forskellige musstammer. MOG92-106 af rotteoprindelse resulterede f.eks. i primær progressiv eller sekundær progressiv EAE i A.SW-mus, mens det fremkaldte tilbagefalds-remitterende EAE i SJL/J-mus46. Dyr af samme stamme bør derfor anvendes. Der er også rapporteret om kønsforskelle i EAE-manifestationen i forskellige tidligere undersøgelser24. Forekomsten af sådanne kønsvirkninger kan meget vel forventes for den protokol, der er beskrevet her, men mangler at blive valideret i yderligere eksperimenter.
Intraperitoneal (IP) administration af en bedøvelsesblanding bestående af 0,02 mg fentanyl, 0,4 mg/mL midazolam og 0,2 mg/mL med medetomidin anvendes til kirurgisk indgreb. Voksne DA-rotter af hannen, der vejer 270 -300 g, kræver ca. 0,4 – 0,6 mL af denne blanding(dvs.~1,5 mL/kg) for at fremkalde en anæstesi, der varer 60 – 90 min. Efter operationen modarbejdes anæstesi ved en subkutan injektion af en modgift bestående af 0,07 mg/mL flumazenil og 0,42 mg/mL atipamezol i fysiologisk saltvand (0,9% NaCl). En dosis på 1 – 1,5 mL/kg modarbejder anæstesi inden for 5 min. Alternativt kan dyrene få lov til at vågne spontant op ved en fysiologisk vask ud af bedøvelsesmidlerne, men i så fald skal dyrene holdes under observation, indtil de er fuldt bevidste.
Andre anæstesi muligheder, der ofte anvendes til dyreoperationer, såsom en IP-injektion af ketamin og xylazin47 eller natrium pentobarbital48, eller en indånding af flygtige anæstesi som isofluoran49 og halothan50, kan også overvejes for operationen præsenteres her. Det er imidlertid afgørende at vælge et bedøvelsesmiddel, der ikke forstyrrer den eller de påtænkte downstream-interventioner.
Under immunisering og intracerebral cytokin injektion, 5% isoflurane anvendes til anæstesi. Den her beskrevne model blev etableret ved hjælp af rotter, og de anførte eksperimentelle detaljer gælder således specifikt for rotten. Kateteret implantation koordinater blev udvalgt til at muliggøre samtidig analyse af mulige hvide stof ændringer (kateteret spidsen i corpus callosum). Mens kateteret indsættelse site kan varieres med hensyn til anteroposterior og lateral position, udvælgelse af den centrale sulcus kræver undgåelse af skader på den overlegne sagittal sinus.
Et andet træk ved den beskrevne metode er den tilsvarende demyelinering af både ipsi- og kontralaterale halvkugler, eventuelt som følge af transporten af den injicerede cytokinblanding til det subarachnoide rum ved den fysiologiske strøm af interstitiel væske fra kortikale områder51. Injektionstilstanden og ikke kateterets placering forårsager derfor demyelination i hele hjernebarken, og valget af højre eller venstre parietal cortex bør derfor være uden betydning i denne henseende.
Protokollen bruger et 26 G kateter, som er lille nok til at undgå omfattende traumatisk skade og stor nok til at undgå en øget tilstopning af kateterets spids i løbet af eksperimentets lange forløb. Implantationen og tilstedeværelsen af kateteret selv forårsager ganske vist en astrocytisk og mikroglial aktivering, også hos de kontroldyr, der kun modtager kateterimplantationen; Dette er dog mindre sammenlignet med de cytokinin injicerede dyr. 43 For at undgå interferens med efterfølgende analyser brugte vi MR-kompatible katetre lavet af polyether-ether-keton (PEEK).
En lignende opsplitningsdybde skabes faktisk i både ipsi- og kontralaterale regioner med den præsenterede metode. Dette indebærer, at kateterets dybde/længde måske ikke spiller en større rolle i mønstret og omfanget af afmyelination i cortex. Derfor kan en ændring af kateterets længde overvejes for at reducere kateterets inducerede læsionsstørrelse. Ikke desto mindre kan en betydeligt kortere kateterlængde forårsage en lidt mindre udtalt kortikal demyelinering, mens et afgørende svar kun opnås ved forsøg, der specifikt tester for kateterets længde.
En fordel ved modellen er, at det implanterede kateter giver mulighed for testning af potentielle terapier, der administreres til cortex via kateteret for at tillade remyelinering ved eller efter toppen af histologisk påviselig kortikal demyelination (dag 15 eller senere), mens dette i en forbehandlingsindstilling ville være efter immuniseringen, men før cytokininjektionen. Beslutningen om tidsrammen for, hvornår terapeutiske midler skal administreres, vil derfor afhænge af det særlige forskningsspørgsmål og det stof, der er af interesse.
Efter kateterimplantation er det vigtigt at anbringe dyr enkelt i de modificerede (helst høje top) bure for at undgå fjernelse af kateter indtil undersøgelsens afslutning (figur 8). Dyr kan også skrue kateterhætten med indløbet, selvom dette sjældent sker. Dyrene skal observeres dagligt, og fjernede hætter bør udskiftes med friske, for at undgå kateterspidsblokering uden indløb og for at sikre en nøjagtig levering til parenchymaet efter intracerebral injektionen. Dyrene immuniseres tidligst 2 uger efter kateterets implantation for at muliggøre heling og lukning af blod-hjerne-barrieren.
Serum anti-MOG antistoftitler skal måles efter immuniseringen. Et dosisresponsforsøg viste, at 5 μg MOG1-125 (i IFA) gav tilstrækkelig immunisering inden for 4 uger hos voksne DA-rotter hos hanner. En titer på 5.000 μg/mL og derover ville være tilstrækkelig, men vil helt sikkert afhænge af flere faktorer, herunder MOG-præparatet og dyrestammen, og skal derfor bestemmes individuelt. Det er vigtigt at undgå for høje antigendoser, hvilket potentielt resulterer i en klassisk EAE-fænotype med lammede bagben allerede før cytokinindsprøjtningen.
Hvert dyr immuniseres med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocyt glycoprotein (rMOG1-125)emulgeret i 200 μL af ufuldstændig Freunds Adjuvans (IFA). Da noget af emulsionen går tabt i sprøjten under forberedelsen, er det tilrådeligt at forberede mere end dette beløb for hvert dyr. Vi brugte rekombinant MOG (1-125 fra N-endestation af rotte MOG), som blev udtrykt i Escherichia coli og blev derefter renset for homogenitet ved chelatkromatografi, opløst i 6 M urea, og dialyzed mod PBS for at opnå et fysiologisk præparat52,53. Kommercielt tilgængelige MOG kan dog også anvendes.
Andre antigenpræparater, såsom MOG1-116, MOG35-55 eller PLP139-151, anvendes i forskellige EAE-modeller, og antigen- og dyrestammeforskelle er kendt for at fremkalde forskellige sygdomsphoenotyper i disse modeller20. Disse antigenpræparater blev ikke testet i DA-rotter, og hvis de anvendes frem for rMOG1-125, kan det fremkalde en sygdomsphoenotype eller histologi, der adskiller sig fra det, der præsenteres her.
En stikkantel af samme længde som kateteret fremstilles inden intracerebral injektionen. Dette kan gøres ved at samle det med et skabelonkateter og skære det i samme størrelse (2 mm i længden) (Figur 4). Det er vigtigt, at stikbeholderen er luftboblefri under cytokinindsprøjtningen – fordi injektionsvolumenet kun er 2 μL, selv en lille luftboble ved kanylespidsen vil reducere væskens volumen betydeligt med succes leveret i hjernen. Dette opnås ved kun at holde pumpen kørende og indsætte kanylen, når der er en voksende dråbe injektionsvæske på spidsen. Efter indføringen af kanylen skrues stikket til kateteret, samtidig med at man undgår overspænding for ikke at beskadige kateterets øverste spids, hvilket vil gøre det vanskeligt at opsummere efter injektionen. Der anvendes en injektionshastighed på 0,2 μL/min for at undgå injektionsinduceret traume. Desuden sikrer en langsom injektion kombineret med en ventetid på 20 minutter efter injektionen udbredelsen af den injicerede væske i interstitiel væske og en effektiv dræning i EFSR’en. Kanylen fjernes derefter langsomt for at undgå en vakuumeffekt.
Den rapporterede metode omfatter kirurgisk indgreb og kræver derfor personale, der er i stand til at udføre stereotaktisk overlevelseskirurgi. Personale i direkte kontakt med dyrene burde have taget de relevante dyreforsøgskurser. Resten af protokollen kan udføres af kompetente laboratoriemedlemmer.
Metoden er beregnet til at producere betændelsesudløset demyelination af hjernebarken og gengiver ikke alle træk ved human MS (f.eks.forekomsten af fokale inflammatoriske hvide stoflæsioner, som er kendetegnende for menneskelig MS).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alt personale fra Institute of Biomedical Research ved Medical University Graz for deres hjælp og samarbejde, samt Christopher John Wrighton for korrekturlæsning af manuskriptet.
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
Screw driver with 2mm tip-size | |||
Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
Exam gloves | |||
Surgical gown | |||
Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |