Protokollen som presenteres her tillater reproduksjon av en utbredt grå materiedeyelinasjon av begge kortikale halvkule hos voksne mannlige Dark Agouti-rotter. Metoden består av intracerebral implantasjon av et kateter, subklinisk immunisering mot myelin oligodendrocytt glykoprotein, og intracerebral injeksjon av en proinflammatorisk cytokinblanding gjennom det implanterte kateteret.
Multippel sklerose (MS) er den vanligste immunmediert sykdom i sentralnervesystemet (CNS) og fører gradvis til fysisk funksjonshemming og død, forårsaket av hvite materielesjoner i ryggmargen og cerebellum, samt ved demyelinering i grå materie. Mens konvensjonelle modeller av eksperimentell allergisk encefalomyelitt er egnet for undersøkelse av cellemediert betennelse i ryggraden og cerebellar hvit materie, klarer de ikke å adressere grå materiepatologier. Her presenterer vi den eksperimentelle protokollen for en ny rottemodell av kortikale demyelinering som tillater undersøkelse av de patologiske og molekylære mekanismene som fører til kortikale lesjoner. Demyelinasjonen er indusert av en immunisering med lavdose myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) i en ufullstendig Freunds adjuvans etterfulgt av et katetermediert intracerebral levering av proinflammatoriske cytokiner. Kateteret muliggjør dessuten flere runder med demyelinasjon uten å forårsake injeksjonsindusert traume, samt intracerebral levering av potensielle terapeutiske legemidler som gjennomgår en preklinisk undersøkelse. Metoden er også etisk gunstig ettersom dyresmerter og nød eller funksjonshemming kontrolleres og relativt minimal. Forventet tidsramme for implementering av hele protokollen er rundt 8 – 10 uker.
MS er en immunmediert, inflammatorisk sykdom i CNS, som hovedsakelig skader myelinplater, men til slutt fører til axonal tap og permanent nevronskade. MS er den vanligste immunmedierte sykdommen i CNS med en estimert prevalens på rundt 2,3 millioner mennesker over hele verden, ifølge National MS Society1, og representerer en stor personlig og sosioøkonomisk byrde. Gjennomsnittlig alder av sykdommen utbruddet er 30 år og fører til tap av produktive år ved å forårsake alvorlig funksjonshemming. MS er for tiden uhelbredelig, og dagens behandlingsmodaliteter tar sikte på å håndtere symptomene under et akutt tilbakefall i relapsing-remitterende MS og å endre sykdomsforløpet for å redusere tilbakefallsfrekvensen ved immunmodulerende behandling2,3. Ingen behandlingsalternativ har ennå vist seg å være effektive for de progressive typene4, med unntak av en nylig klinisk studie av B-celle utarmingsterapi, som viste seg å være effektiv i en undergruppe av primære progressive MS (PPMS) pasienter med aktiv betennelse5. Mens flere potensielle genetiske6- og miljørisikofaktorer7 er identifisert, forblir etiologien til MS imidlertid ukjent.
MS er preget av store inflammatoriske demyeliniserende plakk i, og diffuse skader på, det hvite stoffet8,9. Fokale lesjoner har vært forbundet med et omfattende T-cellemediert angrep, oligodendrocytt ødeleggelse, reaktiv astrogliose og axonal degenerasjon, noe som fører til en motorisk nevronnedgang. Grå materie demyelinering og atrofi har fått anerkjennelse som ytterligere histopalogiske trekk ved sykdommen9,10,11. Sistnevnte har blitt foreslått å bidra til nevrologisk dysfunksjon og kognitiv nedgang hos pasienter12,13. Tre mønstre av kortikale demyelinering har blitt skilt ut, nemlig i) leukocortiske, sammenhengende med de hvite materielesjonene (34%), ii) små, perivasculære (16%), og iii) subpiale (50%). I motsetning til fokale hvite materielesjoner, har disse grå materielesjonene blitt rapportert å mangle et T-cellemediert angrep og er i stedet preget av en forbedret mikroglial aktivering, apoptose og nevronal tap12.
Til dags dato har det ikke vært mulig å rekapitulere menneskelig MS i en enkelt dyremodell, hovedsakelig på grunn av sykdommens kompleksitet. En rekke MS dyremodeller, som hver simulerer forskjellige aspekter av sykdomspatogenese og progresjon, har i stedet blitt utviklet14,15. Nåværende dyremodeller etterligner tre forskjellige sykdomsprosesser: i) fokale inflammatoriske lesjoner, ii) diffus hvit materieskade, og iii) diffus grå materiepatologi.
Dyrestudier av MS white matter plakk har for det meste blitt utført i gnager encefalomyelitt (EAE) modeller. Testdyr immuniseres aktivt med en emulsjon som inneholder et myelinantigen [vanligvis myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG)16,17, myelin grunnleggende protein (MBP)18, eller proteolipidprotein (PLP)19], sammen med en komplett Freunds adjuvans (CFA)20. Sykdommen kan også passivt induseres ved en adoptivoverføring av myelinspesifikke T-celler21. Sykdomsforløpet avhenger av antigen/mus-stammekombinasjonen som brukes. MOG35-55 i C57BL/6 resulterer for eksempel i en monofasisk kronisk sykdom22, mens PLP139-151 hos sveitsiske Jim Lambert (SJL) mus fører til et relapsing-remitterende sykdomskurs23 på en kjønnsspesifikk måte24. Rotte MOG35-55, videre, induserer en encefalitogen T-celle respons, mens menneskelig MOG35-55 induserer B-celleavhengig betennelse i C57BL / 6 mus25. Ulike EAE-modeller gir et utmerket verktøy for å studere cellemediert betennelse primært i ryggmargen og cerebellum, men forebrain strukturer som cortex, corpus callosum og subkortiske strukturer forblir i stor grad spart26. Verken diffus hvit materieskade eller grå materiedemyelinering er i tillegg tilstrekkelig replikert i EAE-modellene26,27. Kortikale demyelinering assosiert med aktiv EAE-induksjon er rapportert i marmosets28,29 og i visse Lewis rotte sub stammer, i sistnevnte tilfelle tilskrevet de rådende kombinasjonene av MHC klasse I og klasse II isotyper og alleler30.
Cuprizone-modellen31 er et nyttig verktøy for å studere diffus hvit materiedemyelinasjon og grå materiepatologi med en omfattende demyelinering av kortikale, sub-kortikale32, og hippocampal33 regioner, samt corpus callosum34 og caudate putamen35. Cuprizoneforgiftning, som i prinsippet resulterer i metabolsk stressindusert apoptose av oligodendrocytter, etterligner noen egenskaper ved de kortikale demyeliniserende lesjonene i MS-hjerner som mikrogliaaktivering, astrogliose og en relativ mangel på infiltrerende perifere immunceller. Mangelen på nevronal apoptose og thalamic atrofi, samt fullstendig oppløsning av demyelinasjon med en robust remyelination observert ved opphør av diett cuprizone tilskudd32, men begrense cuprizoneforgiftningens bruk som en preklinisk MS-modell. Giftig demyelinering kan også induseres ved en fokal injeksjon av lysolecitin eller ethidiumbromid i de hvite materiekanalene36,37, men disse metodene brukes sjelden. Giftige demyelinasjonsmodeller er spesielt egnet for analyse av de komplekse mekanismene for remyelinasjon, for eksempel kravet til oligodendrocytt stamceller og astrocytter38,39. Detaljert informasjon om EAE og beruselsesmodeller er gitt i to nylige anmeldelser15,40.
Den cytokininduserte demyelinasjonen ble opprinnelig utviklet for å studere spinal hvite materielesjoner i EAE41. Senere ble det modifisert for å studere kortikale gråstoffpatologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis rotter er først primet av en sub-klinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ufullstendig Freunds adjuvant (IFA). I motsetning til klassiske EAE-modeller viser disse primede dyrene ikke kliniske symptomer på fokale inflammatoriske lesjoner i ryggmargen. I stedet oppnås en inflammatorisk respons og demyelinasjon i hjernen ved en intracerebral administrering av en proinflammatorisk cytokinblanding [tumornekrosefaktor alfa (TNFα) og interferongamma (IFNγ)] når dyrene har oppnådd en stabil titer av anti-MOG-antistoffer i blodet.
Studier av Merkler et al. 42 og Gardner et al. 44 har bevist effekten av en subpial kortikale demyelinasjonsinduksjon ved en subklinisk MOG-immunisering og en intrarebral eller subarachnoidal cytokininjeksjon. Den rapporterte varigheten av demyelinasjonen var imidlertid for kort-en fullstendig remyelination skjedde i 14 dager eller mindre, og dermed begrense vinduet for noen farmakologisk intervensjon testing. Begge modellene bruker dessuten en traumatisk injeksjonsmodus, som i seg selv kan forårsake et injeksjonstraumer og en blod-hjerne barriere (BBB) sammenbrudd og dermed føre til en ukontrollert rekruttering av inflammatoriske celler i parenchyma. Begge studiene viste videre demyelinering som er begrenset til et begrenset område, i ipsilateral cortex, eller i nærheten av stedet for cytokininjeksjonen.
For å overvinne disse begrensningene implanterte vi et kateter i riktig parietal cortex av DA-rotter, med kateterspissen plassert like over corpus callosum. For å tillate full gjenoppretting av BBB-integriteten, fikk dyrene en hvileperiode på 2 uker etter kateterimplantasjonen. Deretter ble rottene sub-klinisk immunisert med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Etter oppnåelsen av et stabilt anti-MOG antistofftitrøver etter rundt 4 uker ble 2 μL cytokinblanding injisert via kateteret innen 10 minutter ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe. Denne prosedyren fremkalte en utbredt kortikale demyelinering av både ipsi- og de kontralaterale hjernehalvdelene på 15 dager, med en delvis remyelinasjon rundt 30 dager etter cytokinininjeksjon43. Flere demyelinasjonsfaser kan dessuten induseres ved gjentatt administrering av proinflammatoriske cytokiner gjennom kateteret, og global hjerneatrofi, et vanlig trekk ved progressive MS-undertyper45, kan induseres så tidlig som etter den andre demyelinasjonsfasen43. Det er viktig at det implanterte kateteret også kan brukes til å teste farmakologiske inngrep.
Protokollen beskrevet nedenfor gir en detaljert forklaring av de eksperimentelle trinnene for en reproduserbar generasjon av utbredt kortikale demyelinasjon i begge hjernehalvdelene av DA-rotter ved hjelp av et intracerebral kateter.
Vår metode bruker DA rotter. Tilpasningen til mus vil sannsynligvis kreve bruk av et mindre kateter og skruer. Det bør også tas i betraktning at sykdomsforløpet, den inflammatoriske responsen og omfanget av demyelinering kan avvike fra det som presenteres her hvis en annen art / stamme brukes. Slike forskjeller har blitt observert med klassiske EAE-modeller ved hjelp av forskjellige stammer av mus. MOG92-106 av rotteopprinnelse resulterte for eksempel i primær progressiv eller sekundær progressiv EAE i A.SW-mus, mens den induserte relapsing-remitterende EAE i SJL / J mus46. Dyr med samme stamme bør derfor brukes. Kjønnsforskjeller i EAE-manifestasjon er også rapportert i ulike tidligere studier24. Forekomsten av slike kjønnseffekter kan godt forventes for protokollen som er beskrevet her, men gjenstår å validere i ytterligere eksperimenter.
Intraperitoneal (IP) administrering av en bedøvelsesblanding bestående av 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam og 0,2 mg/ml medetomidin brukes til kirurgisk inngrep. Voksne hann-DA-rotter som veier 270 -300 g krever rundt 0,4 – 0,6 ml av denne blandingen (dvs., ~ 1,5 ml / kg) for å indusere en anestesi som varer 60 – 90 min. Etter operasjonen antagoniseres anestesi ved en subkutan injeksjon av en motgift som består av 0,07 mg/ml flumazenil og 0,42 mg/ml atipamezol i fysiologisk saltvann (0,9 % NaCl). En dose på 1 – 1,5 ml/kg motvirker anestesi innen 5 min. Alternativt kan dyrene få lov til å våkne spontant på en fysiologisk vask ut av bedøvelsen, men i så fall må dyrene holdes under observasjon til de er fullt bevisste.
Andre anestesialternativer som ofte brukes til dyreoperasjoner, for eksempel en IP-injeksjon av ketamin og xylazin47 eller natrium pentobarbital48, eller en innånding av flyktige bedøvelser som isofluorane49 og halothane50, kan også vurderes for operasjonen presentert her. Det er imidlertid viktig å velge et bedøvelsesmiddel som ikke forstyrrer de tiltenkte nedstrømsintervensjonen(e).
Under immunisering og intracerebral cytokin injeksjon brukes 5% isofluran til anestesi. Modellen beskrevet her ble etablert ved hjelp av rotter, og de eksperimentelle detaljene som er oppført, er dermed spesielt gjeldende for rotten. Kateterimplantasjonskoordinatene ble valgt for å muliggjøre samtidig analyse av mulige endringer i hvitt materiale (kateterspissen i corpus callosum). Mens kateterets innsettingssted kan varieres med hensyn til anteroposterior og lateral posisjon, krever valget av den sentrale sulcus unngåelse av skade på den overlegne skytten sinus.
Et annet trekk ved den beskrevne metoden er tilsvarende demyelinering av både ipsi- og kontralaterale halvkule, muligens som følge av transport av den injiserte cytokinblandingen til subarachnoid-rommet av den fysiologiske strømmen av interstitialvæsken fra kortikale regioner51. Injeksjonsmodusen, og ikke plasseringen av kateteret, forårsaker derfor demyelinering gjennom hjernebarken, og valget av høyre eller venstre parietal cortex bør derfor være uvesentlig i denne forbindelse.
Protokollen bruker et 26 G kateter, som er lite nok til å unngå omfattende traumatisk skade og stor nok til å unngå økt tilstopping av kateterspissen i løpet av eksperimentet. Implantasjonen og tilstedeværelsen av kateteret selv forårsaker en astrocytisk og mikroglial aktivering, også i kontrolldyrene som bare mottar kateterimplantasjonen; Dette er imidlertid mindre sammenlignet med cytokin-injiserte dyr. 43 For å unngå interferens med påfølgende analyser brukte vi MR-kompatible katetre laget av polyeter-eter-eter-keton (PEEK).
En lignende dybde av demyelinasjon er faktisk opprettet i både ipsi- og kontralaterale regioner med den presenterte metoden. Dette innebærer at kateterets dybde/lengde kanskje ikke spiller en viktig rolle i mønsteret og omfanget av demyelinering i cortex. Derfor kan en modifikasjon av kateterslengden vurderes for å redusere den kateterinduserte lesjonsstørrelsen. Likevel kan en betydelig kortere kateterlengde føre til en litt mindre uttalt kortikale demyelinasjon, mens et avgjørende svar bare vil bli oppnådd ved eksperimenter som spesifikt tester for kateterslengden.
En fordel med modellen er at det implanterte kateteret tillater testing av potensielle terapeutiske behandlinger administrert til cortex via kateteret for å tillate remyelinasjon på eller etter toppen av histologisk påvisbar kortikale demyelinering (dag 15 eller senere), mens i en forbehandlingsinnstilling ville dette være etter immuniseringen, men før cytokininuseringen. Beslutningen om tidsrammen når terapeutiske behandlinger vil bli administrert, vil derfor avhenge av det aktuelle forskningsspørsmålet og stoffet av interesse.
Etter kateterimplantasjon er det viktig å huse dyr enkelt i de modifiserte (helst høye toppen) burene for å unngå fjerning av kateteret til slutten av studien (Figur 8). Dyr kan også skru av kateterhetten med innløpet, selv om dette sjelden skjer. Dyrene bør observeres daglig og fjernede hetter bør erstattes med friske, for å unngå kateterspissblokkering i fravær av et innløp, og for å sikre en nøyaktig levering i parenchyma etter intracerebral injeksjon. Dyrene immuniseres tidligst 2 uker etter kateterimplantasjonen for å tillate helbredelse og lukking av blod-hjernebarrieren.
Serum anti-MOG antistofftiter bør måles etter immunisering. Et doseresponseksperiment viste at 5 μg MOG1-125 (i IFA) ga tilstrekkelig immunisering innen 4 uker hos voksne hann-DA-rotter. En titer på 5000 μg / ml og høyere vil være tilstrekkelig, men vil sikkert avhenge av flere faktorer, inkludert MOG-preparatet og dyrestammen, og må derfor bestemmes individuelt. Det er viktig å unngå for høye antigendoser som potensielt resulterer i en klassisk EAE-fenotype med lammede bakre lemmer selv før cytokininuseringen.
Hvert dyr er immunisert med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocytt glykoprotein (rMOG1-125) emulgert i 200 μL ufullstendig Freunds Adjuvant (IFA). Siden noe av emulsjonen går tapt i sprøyten under preparatet, anbefales det å forberede mer enn dette beløpet for hvert dyr. Vi brukte rekombinant MOG (1-125 fra N-terminus av rotte MOG), som ble uttrykt i Escherichia coli og ble deretter renset til homogenitet ved chelate kromatografi, oppløst i 6 M urea, og dialysert mot PBS for å oppnå et fysiologiskpreparat 52,53. Kommersielt tilgjengelig MOG kan imidlertid også brukes.
Andre antigenpreparater, som MOG1-116, MOG35-55 eller PLP139-151, brukes i forskjellige EAE-modeller, og antigen- og dyrestammeforskjeller er kjent for å indusere distinkte sykdomsfenotyper i disse modellene20. Disse antigenpreparatene ble ikke testet hos DA-rotter, og hvis de brukes i stedet for rMOG1-125, kan det føre til en sykdomsfenotype eller histologiresultater som skiller seg fra det som presenteres her.
En koblingskanyle med samme lengde som kateteret fremstilles før intracerebral injeksjonen. Dette kan gjøres ved å montere det med et malkateter og kutte det i samme størrelse (2 mm i lengde) (Figur 4). Det er viktig at koblingskanylen er luftboblefri under cytokininjeksjonen – fordi injeksjonsvolumet bare er 2 μL, selv en liten luftboble på kanylespissen vil redusere volumet av væsken som leveres inn i hjernen betydelig. Dette oppnås ved å holde pumpen i gang og sette inn kanylen bare når en voksende dråpe injeksjonsvæske er til stede på spissen. Etter kanyleinnsettingen skrues kontakten til kateteret samtidig som den unngår overtettelse for ikke å skade den øvre spissen av kateteret, noe som vil gjøre det vanskelig å oppsummere etter injeksjonen. En injeksjonshastighet på 0,2 μL/min brukes til å unngå injeksjonsindusert traumer. Videre sikrer en langsom injeksjon, kombinert med en 20 min ventetid etter injeksjonen, diffusjonen av den injiserte væsken i interstitialvæsken og en effektiv drenering i CSF. Kanylen fjernes deretter sakte for å unngå vakuumeffekt.
Den rapporterte metoden inkluderer kirurgisk inngrep og krever derfor at personalet kan utføre stereotaktisk overlevelseskirurgi. Personell i direkte kontakt med dyrene skal ha tatt de aktuelle dyreforsøkskursene. Resten av protokollen kan utføres av kompetente laboratoriemedlemmer.
Metoden er ment å produsere betennelsesutløst demyelinering av hjernebarken og reproduserer ikke alle egenskapene til menneskelig MS (f.eks.forekomsten av fokalinflammatoriske hvite materielesjoner, som er et kjennetegn på menneskelig MS).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke alt personell fra Institutt for biomedisinsk forskning ved Medical University Graz for deres hjelp og samarbeid, samt Christopher John Wrighton for korrekturlesing av manuskriptet.
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
Screw driver with 2mm tip-size | |||
Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
Exam gloves | |||
Surgical gown | |||
Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |