Bioluminescent bakterier regulere lys produksjon gjennom en rekke mekanismer som quorum sensing. Denne romanen metoden gjør i situ etterforskningen av bioluminescens og korrelasjon av lys utslipp til celle tetthet. En kunstig bioluminescent Escherichia coli systemet tillater karakterisering av lux operons Lux proteiner og deres samspill.
Det er et betydelig antall bakteriell arter i stand til å slippe lys. Alle deler samme genet klyngen, nemlig de lux operon. Til tross for denne likheten viser disse bakteriene ekstreme variasjoner i egenskaper som vekst atferd, intensiteten av lys utslipp eller regulering av bioluminescens. Metoden som presenteres her er en nyutviklet analysen som kombinerer opptak av cellevekst og bioluminescent lys utslippsintensitet over tid utnytte en plate-leser. Det resulterende vekst og lys utslipp egenskaper kan være knyttet til viktige funksjoner av respektive bakterielle belastningen, som quorum sensing regulering. Dyrking av en rekke bioluminescent bakterier krever et bestemt medium (f.eks kunstig havet vann medium) og definert temperaturer. Den lett å håndtere, ikke-bioluminescent standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), derimot, kan være dyrket billig i høye mengder i laboratoriet skala. Utnytte E. coli ved å innføre en plasmider som inneholder hele lux operon kan forenkle eksperimentelle forhold og i tillegg åpner opp mange muligheter for fremtidige anvendelser. Uttrykket av alle lux gener utnytte en E. coli uttrykk belastning ble oppnådd ved bygging av en uttrykk plasmider via Gibson kloning og innsetting av fire fragmenter som inneholder syv lux gener og tre vrbord gener av lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli basert lux genuttrykk kan indusert og styres via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tillegg resulterer i bioluminescent E. coli celler. Fordelene ved dette systemet er å unngå quorum sensing regulering restriksjoner og komplekse middels komposisjoner med ikke-standard vekst forhold, slik som definert temperaturer. Dette systemet muliggjør analyse av lux gener og deres samspill, utelukkelse av respektive genet fra lux operon, eller med tillegg av romanen gener, utveksle luxAB gener fra en bakteriell stamme av en annen, eller analysere protein komplekser, som luxCDE.
Utslipp av lys av levende organismer (bioluminescens) er en fascinerende prosessen i bakterier, sopp, insekter, nematoder, fisk og blekksprut1. Bioluminescent lys utslipp kommer fra en chemiluminescent reaksjon som kjemisk energi er (delvis) forvandlet til lys energi (“kaldt lys”). I bioluminescent bakterier gir heterodimeric enzymet luciferase monooxygenation med langkjedete alifatisk aldehyder, som tetradecanal, til den tilsvarende syren ledsaget av lys utslipp med maksimalt 490 nm2, 3.
Figur 1 : Generelle reaksjonen ordningen med bakteriell luciferase. Det bakteriell luciferase (LuxAB) gir monooxygenation med langkjedete aldehyder (CH3(CH2)nCHO) ved å benytte redusert flavin mononucleotide (FMNH2) og molekylære oksygen (O2), gir produktene lang kjede syrer (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vann (H2O) og utslipp av lys sentrert på 490 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Energien som frigjøres under denne oksidasjon forårsaker en glade tilstand FMN-4a-lut, som fungerer som lys emitting luciferin4. Proteiner involvert i bakteriell bioluminescens, nemlig LuxCDABEG, er kodet av lux operon og er svært bevart over ulike bakteriell stammer2,5. Gener luxA og luxB kode for heterodimeric luciferase; Luxc’sog Luxd’s Luxe’s gene produkter er en fettsyre reduktase sammensatt; og luxG koder for en flavin reduktase6. En rekke bioluminescent Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bærer ekstra luxF genet. Det ble rapportert at LuxF er et homodimeric protein som binder uvanlig flavin derivat 6-(3′-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Flere gener er identifisert som er ansvarlig for riboflavin syntese (f.eks ribEBH) og videre regulatory gener er rapportert, som spiller en rolle i quorum sansing regulering av bioluminescens, spesielt for Vibrio fischeri og Vibrio harveyi6,13. Til tross for høyt konservert genet orden viser bioluminescent bakterier høy variasjoner i egenskaper som vekst oppførsel, intensitet av lys utslipp eller regulering av bioluminescens2,5,14 .
Flere endret stammer eller plasmider inneholder deler eller hele lux operons er kjent, utnytte bioluminescens som reporter systemer. Programmer som bestemmer promoter aktivitet, overvåking av bakteriell forurensing i miljøet eller mat prøver, bioluminescens resonans energi overføring (BRET), i vivo bildebehandling av infeksjoner i eukaryote organismer, var etablert15,16,17pyrosequencing og så videre. Interessant, brukte tre mest bioluminescent reporter systemer er avledet fra den nordamerikanske firefly (Photinus pyralis), enteric patogen av nematoder (Photorhabdus luminescens) og havet stemorsblomst (Renilla reniformis). Ingen av disse systemene har en bakteriell opprinnelse, men bruk av lux gener og operons fra bakteriell opprinnelse er stadig mer interesse for anvendt forskning16. Mindre rikelig programmet bioluminescens proteiner bakteriell kilder skyldes hovedsakelig lavere stabilitet og lang levetid av bakterier avledet selvlysende proteiner som kan være relatert til deres marine habitater. Bioluminescent bakterier med marine habitater er ikke dyrket under standard lab forhold. Disse bakteriene krever bestemte vekst medier og forhold, som kunstig havet vann medium og lavere vekst/inkubasjon temperaturer (f.eks 28 ° C).
For å forenkle sammenligning av lux operon egenskaper eller enkelt lux gener av en rekke ulike bioluminescent bakteriell stammer, en metode for å standardisere lux operon uttrykk og analyse er en forutsetning. Dermed kom ideen om å integrere hele lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). For dette formålet, Gibson forsamlingen viste seg for å være et nyttig verktøy å integrere flere lineær, overlappende fragmenter i et uttrykk vektor uten behov for spesifikk begrensning nettsteder. Denne metoden passer også når DNA setter er for stor (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH, ~ 9 kb operon størrelse) mikrofonfunksjon via PCR. En lux operon kan deles inn i flere overlappende fragmenter, og settes sammen til ett uttrykk plasmider og til slutt sekvensen bekreftet montering produktet kan omdannes til en passende E. coli systemet for høykapasitets protein uttrykk18,19,20. I tillegg til enkelt å håndtere E. coli basert lux genuttrykk, gjensto en enkel metode kombinere opptak av cellevekst og bioluminescent lys utslipp å bli etablert. Metoden beskrevet her kan i situ måling og korrelasjon av cellen og lys utslipp av bioluminescent bakterier.
Analyse av lux gener og lux operon orden og regulering av forskjellige bioluminescent bakterier, på den ene siden, en kunstig bioluminescent E. coli systemet med hele lux-rib operon av s. mandapamensis 27561, og på den andre hånden, en nyutviklet plate leser analysen kombinere i situ innspillingen cellen tetthet og lys utslipp, bidrar til å få mer informasjon om de ulike bakterielle lux -systemene. Denne grunnleggende karakterisering og sammenligning av luciferases og relaterte enzymer kan føre til alternativer til allerede etablerte reporter systemer med forbedret stabilitet og aktivitet.
Byggingen av et uttrykk plasmider inneholder fire fragmenter komponere hele lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 ble nådd via Gibson kloning. Denne E. coli basert lux genuttrykk kan E. coli cellene avgir lys. Unngå quorum sensing regulering og ikke-standard vekst forhold er betydelige fordeler av dette systemet.
Fordelene med å bruke Gibson kloning strategi er lett montering av flere lineær DNA fragmenter, høy fleksibilitet og nei nød for spesifikk begrensning nettsteder18,19,20. Denne metoden kan enkelt endre en lux operon, unntatt én gener eller genet klynger eller innføre nye gener eller utveksle gener fra en stamme med hverandre. En forutsetning for bruk av denne metoden er tilgjengeligheten av respektive lux operon genet sekvensen. Bare for et lite antall bioluminescent bakterier er fullstendig DNA sekvensen av respektive lux operon kjente og/eller tilgjengelig. Mange av disse sekvensene er fragmentert fordi de ble generert ved hjelp av hagle sekvensering. Den undersøkte P. mandapamensis 27561 komplett DNA sekvensen av lux operon er kjent og tilgjengelig fra NCBI gene databasen (GenBank: DQ988878.2).
En kritisk trinn i protokollen av Gibson er beregningen av DNA konsentrasjonen av enkelt fragmenter. I samlingen protokollen av produsenten det ble anbefalt å bruke 0.2 – 0,5 pmols og et totalvolum på 20 µL for 4-6 fragmenter20,21. I vårt tilfelle, der luxCDABFEG-ribEBH består av 4, var konsentrasjoner og totalt volum 0,1 pmol og 45 µL, henholdsvis avhengig av avkastningen av PCR produkter. På den ene siden, konsentrasjonen måtte reduseres og derimot, volumet måtte økes. Likevel forsamlingen fungerte veldig bra og DNA sekvensering bekreftet riktig innsetting på første forsøk. Dette funnet bekreftet Gibson montering som en robust og hensiktsmessig metode for våre undersøkelser, som lett kan modifisert18,19,20.
Nyetablerte plate leser analysen er lett å håndtere metoden. Muliggjør en enkel primær analyse av nye eller (un-) kjent bioluminescent bakteriell stammer og gir allerede en første hint på regulatoriske mekanismen av lyset produksjon (f.eks lag i luminescence på lav celle tettheter). I tillegg kan vekst forhold i kombinasjon med lys produksjon lett bli vurdert ved å endre oppblomstringen medium eller temperatur.
Målene med plate leseren ble utført på 28 ° C. Grunnen til dette uvanlig setting er temperatur følsomheten av bioluminescent bakteriell stammer, hvor temperaturer over 30 ° C føre til mindre eller ingen vekst og/eller lys utslipp. Oppmerksom på at platen leseren er i stand til å holde en definert temperatur over tid begrensningen av manglende aktive kjølesystem. Derfor har temperaturen lavere temperaturen på målingen.
Som et bevis på konseptet, sammenligning av E. coli Konstruer med bioluminescent belastningen P. mandapamensis (figur 5) på den ene siden og referanse målinger (Figur 4) derimot ble utført og Bekreft påliteligheten til nyopprettede systemet. I tillegg sikret langsiktige målet levetiden til lys utslipp (figur 6). Men man må vurdere at OD verdier ikke er pålitelig over en viss optisk tetthet, avhengig av egenskapene til bruker enheten (ca 15 h i den foreliggende sak) der en passende fortynning ville være nødvendig for en måling i den lineær rekke detektoren. Disse høye avvik i OD verdier gjøre disse lenge målingene ikke pålitelig. Derfor anbefales kortere mål som 10t bruk eksperimentelle rapporterte her.
Begrensninger av etablerte plate leser analysen kan ses i figur 7. Vanskeligheten er å finne en riktig innstilling for målingen. ‘Få verdien’ justererer følsomheten på Foto multiplikator røret (betaling). Gevinsten er forsterkningen på signalet i avdrag, betyr at en høyere gevinst faktor vil øke signalet. Hvis gevinsten er satt for lavt signal til støyforhold blir større og lys intensiteter av “lavt” skinnende bioluminescent bakterier ikke målt noen mer (signaler nær null, data ikke vist). Utfordringen i en bioluminescent analysen er å angi forsterkningen slik måleresultatene for alle bakteriell stammer innenfor rekkevidden av instrumentet. I tillegg Måleområde for luminescence avhenger intervalltiden måling (f.eks maksimalt 2.000.000 for 1 s).
Gevinsten ble satt til 2800, som var empirisk testet og valgt for bestemte plate leseren brukes for etablering av denne metoden. Innstillingen brukes gevinst gjør opptak av maksimal slippes ut lys av den bioluminescent E. coli system, P. mandapamensis 27561 og P. mandapamensis S1 uten overflyt, men for stammer P. mandapamensis TH1 og V. harveyi 14126 gevinsten var for høy. Derfor disse sistnevnte stammer overskrider grensen på gjenkjenning og ekte maksimal lysintensiteten ikke kan måles. Denne tekniske begrensningen kan hindre sammenligning av bioluminescent bakterier, som viser høy variasjoner i maksimal lys utslipp, selv om vekst forhold og celle tettheter kan være sammenlignbare.
Plassering av analysert bakteriell stammene i brukt godt platene må vurderes empirisk. Selv om svart bra plater med glassbunn ble brukt, ble crosstalk mellom prøvene observert. Lysintensiteten til spesifikke stammer er så høy, at alle nærliggende brønner vil vise false positiv lys utslipp (f.eks tomt). Derfor er det viktig å måle to ulike stammer enten separat eller sammen med en viss romlig separasjon til hverandre.
Det er allerede mange endret E. coli stammer kjent som inneholder deler av lux operon og er hovedsakelig program-orientert15,16,17. Metodene som er beskrevet her, sikte på grunnforskning, for eksempel muligheten til å analysere hver lux genet separat. Selv om forskning på bioluminescens har en lang historie, er det fortsatt mange åpne spørsmål. Unntatt eller introdusere gener fra lux operon, utveksle luxAB gener med genene fra en annen belastning eller analysere protein komplekser, innebygd i den lett å håndtere E. coli systemet og ytterligere anvendelse av platen leser analysen, kan det være mulig å få mer informasjon om regulatoriske prosesser og funksjonene til lux gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) for sin støtte i å etablere selv skrevet skriptet for plate leseren. Dette arbeidet ble støttet av østerrikske “Fonds zur Förderung der overvektig Forschung” (FWF) til PM (P24189) og PhD-programmet “DK molekylær Enzymology” (W901) til PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |