Bacterias bioluminiscentes regulan la producción de luz a través de una variedad de mecanismos, como la detección de quórum. Este novedoso método permite la investigación en situ de bioluminiscencia y la correlación de emisión de luz a la densidad celular. Un artificial bioluminiscente Escherichia coli el sistema permite la caracterización de los operones de lux , Lux proteínas y su interacción.
Hay un número considerable de especies bacterianas capaces de emitir luz. Todos ellos comparten el mismo racimo del gene, es decir, el operón lux . A pesar de esta similitud, estas bacterias presentan variaciones extremas en características como el comportamiento del crecimiento, intensidad de emisión de luz o regulación de la bioluminiscencia. El método presentado aquí es un ensayo desarrollado recientemente que combina grabación de crecimiento celular y la intensidad de emisión de luz bioluminiscente en el tiempo utilizando un lector de placas. El crecimiento resultante y las características de la emisión de luz pueden vincularse con importantes características de la cepa bacteriana respectiva, tales como quórum sensing Reglamento. El cultivo de una amplia gama de bacterias bioluminiscentes requiere un medio específico (por ejemplo, medio de agua de mar artificial) y define las temperaturas. Fácil de manejar, no bioluminiscente estándar-investigación bacteria Escherichia coli (e. coli), por el contrario, se puede cultivar económicamente en grandes cantidades en escala de laboratorio. Explotación de e. coli mediante la introducción de un plásmido que contiene el todo lux operon puede simplificar las condiciones experimentales y además abre muchas posibilidades para futuras aplicaciones. La expresión de los genes lux utilizando una cepa de e. coli expresión fue alcanzada por la construcción de un plásmido de expresión a través de clonación de Gibson y la inserción de cuatro fragmentos que contienen siete genes lux y tres genes de la costilla de el operón lux-costilla en un vector de pET28a. Expresión génica de e. coli pt lux puede ser inducida y controlada vía la adición de Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) dando por resultado bioluminiscente de e. coli las células. Las ventajas de este sistema son evitar el quórum sensing Reglamento restricciones y composiciones complejas medio junto con las condiciones de crecimiento no estándar, tales como define las temperaturas. Este sistema permite el análisis de los genes lux y su interacción, mediante la exclusión del gen respectivo desde el operón lux , o incluso adición de nuevos genes, intercambiando el luxAB los genes de una cepa bacteriana por otro, o Análisis complejos de la proteína, tales como luxCDE.
La emisión de luz por organismos vivos (bioluminiscencia) es un proceso fascinante encontrado en bacterias, hongos, insectos, nematodos, peces y calamares1. Emisión de luz bioluminiscente surge de una reacción quimioluminiscente en el que la energía química (parcialmente) se transforma en energía de la luz (“luz fría”). En bacterias bioluminiscentes, la luciferasa de heterodiméricos enzima cataliza el monooxygenation de cadena larga, Aldehídos alifáticos, como el tetradecanal, a los ácidos correspondientes acompañados de emisión de luz con un máximo de 490 nm2, 3.
Figura 1 : Esquema general de la reacción de luciferase bacteriana. La luciferasa bacteriana (LuxAB) cataliza la monooxygenation de cadena larga aldehídos (CH3(CH2)nCHO) utilizando reducción fosfato de lactoflavina (FMNH2) y oxígeno molecular (O2), rindiendo los productos cadena larga ácidos (CH3(CH2)nCOOH), fosfato de lactoflavina (FMN), agua (H2O) y la emisión de luz centrada a 490 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La energía liberada durante esta oxidación produce un estado excitado FMN-4a-hidróxido, que sirve como el luciferin4de emisión de luz. Las proteínas implicadas en bioluminescence bacteriano, es decir, LuxCDABEG, son codificadas por el operón lux y se conservan altamente en varias cepas bacterianas2,5. Los genes luxA y luxB codifican para la luciferasa heterodiméricos; productos del gen de luxC, de luxDy de luxE son componentes de una reductasa de ácidos grasos complejo; y luxG codifica para una reductasa de flavin6. Un número de bioluminiscente Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) portan el gen adicional luxF . Se informó de que LuxF es una proteína homodiméricas que se une el flavin inusual derivado 6-(3′-(R)-MIRISTILO)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Se han identificado genes adicionales que son responsables de la síntesis de riboflavina (por ejemplo, ribEBH) y además genes reguladores se han divulgado, que juegan un papel en la regulación de detección de quórum de bioluminiscencia, especialmente para Vibrio Fischeri y Vibrio Ricque6,13. A pesar de la orden de genes altamente conservados, bacterias bioluminiscentes demuestran altas variaciones en características como el comportamiento del crecimiento, intensidad de emisión de luz, o reglamento de bioluminiscencia2,5,14 .
Varios modificación cepas o plásmidos que contienen partes o todo lux operones son conocidos, explotando la bioluminiscencia como sistemas de reportero. Diversas aplicaciones como la determinación de actividad de promotor, monitoreo de contaminación bacteriana en el ambiente o muestras de la comida, bioluminiscencia resonancia energética de transferencia (BRET), en vivo la proyección de imagen de las infecciones en los organismos eucariotas, Pirosecuenciación y así sucesivamente fueron establecidos15,16,17. Curiosamente, los tres más usados reportero bioluminiscente sistemas derivan de la luciérnaga de América del norte (Photinus pyralis), el patógeno entérico de nematodos (luminescens de Photorhabdus) y el pensamiento del mar (Renilla lugares). Ninguno de estos sistemas tiene un origen bacteriano, pero el uso de lux genes y operones de origen bacteriano está cobrando más interés para la investigación aplicada16. La aplicación menos abundante de las proteínas de la bioluminiscencia de fuentes bacterianas principalmente debido a la menor estabilidad y longevidad de las bacterias derivados proteínas luminiscentes que pueden estar relacionadas con su hábitat marino. Bacterias bioluminiscentes de hábitats marinos no son cultivables en condiciones estándar de laboratorio. Estas bacterias requieren medios de cultivo específicos y condiciones, como la artificial agua medio y bajo crecimiento/incubación las temperaturas del mar (por ejemplo, 28 ° C).
Para simplificar la comparación de características de operón lux o solo lux genes de una variedad de diferentes cepas de bacterias bioluminiscentes, un método para estandarizar el análisis y la expresión del operón de lux es un requisito previo. Así, surgió la idea de integrar el operón entero lux-costilla en el estándar de investigación bacteria Escherichia coli (e. coli). Para ello, Asamblea de Gibson demostró para ser una herramienta útil para integrar múltiples fragmentos lineales, superpuestas en vector de una expresión sin la necesidad de sitios de restricción específicos. Este método también es conveniente cuando son demasiado grandes insertos de DNA (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG ribEBH; ~ 9 kb operon tamaño) para ser amplificados por PCR. Un operón lux se puede dividir en múltiples fragmentos superpuestos, a continuación, se montar en el plásmido de una expresión y finalmente la secuencia verificado producto de montaje puede ser transformada directamente en un apropiado e. coli sistema de alto rendimiento expresión de la proteína18,19,20. Además de la fácil de manejar la expresión génica de e. coli pt lux , un método sencillo que combina la grabación de crecimiento celular y la emisión de luz bioluminiscente seguía siendo para establecerse. El método aquí descrito permite la medición en situ y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes.
El análisis de los genes lux y lux operon orden y regulación de varias bacterias bioluminiscentes, por un lado, un artificial bioluminiscente de e. coli sistema que contiene el operón entero lux-costilla de P. mandapamensis 27561 y, por otro lado, un ensayo de placa nuevo lector combina la grabación en situ de densidad celular y una emisión de luz, ayuda a obtener más información sobre los distintos sistemas bacterianos lux . Esta caracterización fundamental y comparación de luciferasas y enzimas relacionadas pueden conducir a alternativas a los sistemas ya establecidos reportero con actividad y estabilidad mejorada.
La construcción de un plásmido de expresión que contienen cuatro fragmentos de componer el operón entero lux-costilla de mandapamensis p. 27561 se logró a través de clonación de Gibson. Esta expresión de genes de e. coli pt lux permite a e. coli las células emiten luz. Evitar el quórum sensing Reglamento y condiciones de crecimiento no estándar es ventajas substanciales de este sistema.
Las ventajas de utilizar la estrategia de clonación de Gibson son el fácil montaje de múltiples fragmentos de ADN lineales, alta flexibilidad y sin necesidad de restricción específicos sitios18,19,20. Este método permite cambiar fácilmente de un operón lux , excluyendo genes individuales o grupos de genes, introducción de nuevos genes o intercambio de genes de una cepa con el otro. Un requisito previo para la aplicación de este método es la disponibilidad de la secuencia del gen respectivo lux operon. Sólo para un pequeño número de bacterias bioluminiscentes es la secuencia completa del ADN del respectivo lux operon conocido y disponible. Muchas de estas secuencias están fragmentados porque se generaron utilizando secuenciación de escopeta. En el caso de los investigados mandapamensis p. 27561 la secuencia completa del ADN de la operón lux es conocido y están disponibles en la base de datos NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).
Un paso crítico en el protocolo de la Asamblea de Gibson es el cálculo de la concentración de ADN de los fragmentos individuales. En el protocolo de montaje del fabricante se recomienda utilizar 0,2 – 0,5 pmols y un volumen total de 20 μl para 4-6 fragmentos20,21. En nuestro caso, donde luxCDABFEG-ribEBH se compone de 4 fragmentos, las concentraciones y volúmenes totales fueron 0.1 pmol y 45 μl, respectivamente, dependiendo de la producción de productos de la PCR. Por un lado, la concentración tuvo que ser reducido y por otro lado, el volumen tuvo que incrementarse. Sin embargo, la Asamblea funcionaba muy bien y secuencia de la DNA confirmó la correcta inserción en el primer intento. Este hallazgo confirmó Asamblea de Gibson como un método robusto y adecuado para nuestras investigaciones, que pueden ser fácilmente modificados18,19,20.
La flamante placa lector es un fácil método de manejar. Permite un análisis primario simple de nuevo o (ONU-) cepas de bacterias bioluminiscentes y da ya un primer indicio sobre el mecanismo regulador de la producción de luz (p. ej., retraso en la luminiscencia en las densidades bajas de la célula). Además, las condiciones de crecimiento en combinación con la producción de luz pueden evaluarse fácilmente cambiando simplemente un medio o la temperatura.
Se realizaron las mediciones con el lector de la placa a 28 º C. La razón de esta configuración inusual es la sensibilidad de temperatura de cepas de bacterias bioluminiscentes, donde las temperaturas sobre 30 ° C a menos o incluso ningún crecimiento o emisión de luz. Tenga en cuenta que el lector es capaz de mantener una temperatura definida en el tiempo con la limitación de no activa sistema de enfriamiento. Por lo tanto, la temperatura debe ser inferior a la temperatura de la medida.
Como una prueba de concepto, la comparación de la estructura de e. coli con la cepa bioluminiscente p. mandapamensis (figura 5) en la una mano y las medidas de referencia (figura 4) por otro lado se realizaron y confirmar la fiabilidad de este sistema recién creado. Además, la medición a largo plazo asegura la longevidad de la emisión de luz (figura 6). Pero uno tiene que considerar que los valores de OD no son fiables por encima de cierta densidad óptica, dependiendo de las características del dispositivo de medición utilizado (aproximadamente 15 h en el presente caso) donde se necesitaría una dilución apropiada para una medición en el rango lineal del detector. Estas altas variaciones en los valores de OD hacen estas mediciones de tiempo no es fiable. Por lo tanto, medidas más cortas como 10 h se recomiendan la configuración experimental divulgado aquí.
Limitaciones del ensayo de lector de placa establecido pueden verse en la figura 7. La dificultad es encontrar un ajuste apropiado de la medida. La valor de ganancia ajusta la sensibilidad del tubo Foto multiplicador (PMT). La ganancia es la amplificación de la señal en el PMT, lo que significa que un mayor factor de ganancia aumentará la señal. Si la ganancia se establece demasiado baja, la relación señal a ruido se hace más grande e intensidades de luz de bacterias bioluminiscentes brillantes “bajas” no se puede medir cualquier (señales más cercano a cero, datos no mostrados). El reto en un ensayo bioluminiscente es para ajustar la ganancia para los resultados de medición para todas las cepas bacterianas dentro de la gama del instrumento. Además, la gama de medición de luminiscencia depende el tiempo de intervalo de medición (por ejemplo, máximo de 2.000.000 para 1 s).
El aumento fue fijado a 2800, que fue empíricamente probado y seleccionado para el lector de placa específico utilizado para el establecimiento de este método. El ajuste de ganancia utilizado permite la grabación de máxima luz emitida por el bioluminiscente sistema de e. coli , p. mandapamensis 27561 y p. mandapamensis S1 sin exceso, pero para las cepas de p. mandapamensis TH1 y V. Ricque 14126 la ganancia era demasiado alta. Por lo tanto, estas cepas de este último excedan el límite de detección y no se puede medir la intensidad de la luz real máxima. Esta limitación técnica puede evitar la comparación de bacterias bioluminiscentes, que muestran variaciones alta emisión de luz máxima, aunque las condiciones de crecimiento y las densidades de célula podrían ser comparables.
Posicionamiento de las cepas bacterianas analizadas dentro de las placas bien usadas tiene que ser evaluadas empíricamente. Aunque se utilizaban placas bien negro con fondo de vidrio, observó interferencia entre las muestras. La intensidad de luz de cepas específicas es tan alta, que todos los pozos vecinos muestran falsas emisiones de luz positivas (por ejemplo, en blanco). Por lo tanto, es importante medir dos cepas diferentes, ya sea por separado o con una cierta separación espacial entre sí.
Ya hay muchos modificación cepas de e. coli se sabe que contienen partes de la operón lux y están principalmente orientados a la aplicación de15,16,17. Los métodos descritos aquí, tienen como objetivo la investigación fundamental, por ejemplo la posibilidad de analizar por separado cada gen lux . Aunque la investigación de bioluminescence tiene una larga historia, todavía hay muchas preguntas abiertas. Por excluyendo la introducción de genes del operón lux , intercambiando los genes luxAB con genes de otra cepa o analizar proteína complejos, incrustado en el fácil de manejar sistema de e. coli y otro uso de la placa Análisis del lector, es posible obtener más información sobre procesos de regulación y las funciones de los genes lux .
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) por su apoyo en el establecimiento de la escritura de la uno mismo-escrita para el lector de la placa. Este trabajo fue apoyado por el austriaco “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) a h (P24189) y el programa de doctorado “DK Molecular enzimología” (W901) a PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
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FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
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