Självlysande bakterier reglerar ljus produktion genom olika mekanismer, såsom quorum sensing. Denna nya metod kan i situ utredningen av Mareld och sambandet mellan den ljusa utsläppet till cell densiteten. En konstgjord självlysande Escherichia coli systemet tillåter karakterisering av lux operons, Lux proteiner och deras samspel.
Det finns ett stort antal bakteriearter kan avge ljus. Alla delar samma gen kluster, nämligen de lux operon. Trots denna likhet visar dessa bakterier extrema variationer i egenskaper som tillväxt beteende, intensiteten i ljusöppningen eller reglering av Mareld. Metoden presenteras här är en nyutvecklad som kombinerar inspelning av celltillväxt och självlysande ljusöppningen intensitet över tid utnyttja en spektrofotometer. De resulterande tillväxt och ljusöppningen egenskaper kan kopplas till viktiga funktioner i respektive bakteriell stam, såsom quorum sensing förordning. Odling av ett spektrum av självlysande bakterier kräver ett specifikt medium (t.ex. konstgjorda havet vatten medium) och definierade temperaturer. Lätt att hantera, icke-självlysande standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), däremot, kan odlas billigt i stora mängder i laboratorieskala. Att utnyttja E. coli genom att införa en plasmid som innehåller den hela lux operon kan förenkla experimentella förhållanden och öppnar dessutom upp många möjligheter för framtida tillämpningar. Uttrycket av alla lux gener utnyttja en E. coli uttryck stam uppnåddes genom byggandet av ett uttryck plasmid via Gibson kloning och införande av fyra fragment som innehåller sju lux gener och tre revben gener av de lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli baserat lux genuttryck kan inducerad och kontrolleras via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tillägg resulterar i självlysande E. coli celler. Fördelarna med detta system är att undvika quorum sensing förordning begränsningar och komplexa medium kompositioner tillsammans med icke-standardiserade tillväxt villkorar, som definierade temperaturer. Detta system möjliggör analys av lux gener och deras samspel, genom uteslutning av den respektiva genen från de lux operon, eller även tillägg av nya gener, utbyta de luxAB -generna från en bakterie stam av en annan, eller analysera proteinkomplex, såsom luxCDE.
Utsläpp av ljus av levande organismer (Mareld) är en fascinerande process Funna i bakterier, svampar, insekter, nematoder, fiskar och bläckfiskar1. Självlysande ljusöppningen framgår en kemiluminiscent reaktion där kemisk energi (delvis) omvandlas ljusenergi (”kallt ljus”). I självlysande bakterier katalyserar de heterodimeriskt enzymet luciferas monooxygenation av långkedjiga, alifatiska aldehyder, såsom tetradecanal, till motsvarande syror åtföljs av ljusöppningen med ett maximum på 490 nm2, 3.
Figur 1 : Allmänna reaktionsformel av bakteriell luciferas. Den bakteriella luciferas (LuxAB) katalyserar monooxygenation av långkedjiga aldehyder (CH3(CH2)nCHO) genom att utnyttja minskat flavin mononucleotide (FMNH2) och molekylärt syre (O2), framställning av produkterna lång kedja syror (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vatten (H2O) och utsläpp av ljuset centrerat på 490 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den energi som frigörs under denna oxidation orsakar ett exciterat tillstånd FMN-4a-hydroxid, som fungerar som den ljusavgivande luciferin4. Proteinerna som är involverade i bakteriell Mareld, nämligen LuxCDABEG, kodas av de lux operon och bevaras mycket över olika bakteriestammar2,5. De gener luxA och luxB koda för den heterodimeriskt luciferas; Luxc’s, Luxd’soch luxE genprodukter är delar av en fettsyra reduktas komplex; och luxG kodar för en flavin reduktas6. Ett antal självlysande Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bär genen ytterligare luxF . Det rapporterades att LuxF är ett homodimeric protein som binder den ovanliga flavin derivat 6-(3′-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Ytterligare gener har identifierats som ansvariga för riboflavin syntes (t.ex. ribEBH) och dessutom regleringsgener har rapporterats, som spelar en roll i quorum sensing reglering av Mareld, särskilt för Vibrio fischeri och Vibrio harveyi6,13. Trots mycket gen beställa visar självlysande bakterier hög variationer i egenskaper som tillväxt beteende, intensiteten i ljusöppningen, eller förordning av Mareld2,5,14 .
Flera modifierade stammar eller plasmider innehåller delar eller hela lux operons är kända, att utnyttja Mareld som reporter system. Olika applikationer såsom fastställande av promotorn verksamhet, övervakning av bakteriella föroreningar i miljön eller mat prov, Mareld resonans energi överföring (BRET), in-vivo avbildning av infektioner i eukaryota organismer, pyrosekvensering, och så vidare var etablerade15,16,17. Intressant, vanligaste tre självlysande reporter system härleds från den nordamerikanska firefly (Photinus mottfjärilar), enteriska patogener av nematoder (Photorhabdus hjälp) och den havet pansy (Renilla reniformis). Ingen av dessa system har en bakterie-beskärningen, men användningen av lux gener och operons från bakteriell ursprung vinner mer intresse för tillämpad forskning16. Mindre riklig tillämpningen av Mareld proteiner från bakteriell källor beror främst på lägre stabilitet och livslängd av bakterier härrör självlysande proteiner som kan relateras till deras marina livsmiljöer. Självlysande bakterier av marina livsmiljöer är inte odlingsbara standard lab villkor. Dessa bakterier kräver specifika tillväxt medier och villkor, såsom konstgjorda havet vatten medium och lägre tillväxt/inkubation temperaturer (t.ex. 28 ° C).
För att förenkla jämförelse av lux operon egenskaper eller enda lux gener av en rad olika självlysande bakteriestammar, en metod för att standardisera lux operon uttryck och analys är en förutsättning. Således uppstod tanken på att integrera den hela lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). För detta ändamål, Gibson församlingen visat sig vara ett användbart verktyg för att integrera flera linjära, överlappande fragment i ett uttryck i vektor utan behov av särskilda begränsningar platser. Denna metod är också lämplig när DNA skär är för stora (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon storlek) kan förstärkas via PCR. En lux operon kan delas in i flera överlappande fragment, sedan monteras till ett uttryck i plasmid och slutligen sekvensen verifierade församlingen produkt direkt kan omvandlas till en lämplig E. coli system för hög kapacitet protein uttryck18,19,20. Förutom den lätthanterlig E. coli baserat lux genuttryck, återstod en enkel metod som kombinerar inspelning av celltillväxt och självlysande ljusa utsläppet fastställas. Den metod som beskrivs här kan i situ mätning och korrelation mellan cell densiteten och ljusa utsläppet av självlysande bakterier.
Analysen av lux gener, lux operon ordning och reglering av olika självlysande bakterier med, å ena sidan, en konstgjord självlysande E. coli system som innehåller den hela lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 och, å andra hand, en nyutvecklad plattan läsaren analysen kombinerar i situ inspelning av cell densiteten och ljusöppningen, hjälper till att få mer information om de olika bakteriella lux -system. Denna grundläggande karakterisering och jämförelse av luciferases och relaterade enzymer kan leda till alternativ till de redan etablerade reporter system med förbättrad stabilitet och verksamhet.
Byggandet av ett uttryck plasmiden som innehåller fyra fragment komponera den hela lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 uppnåddes via Gibson kloning. Detta E. coli baserat lux genuttryck kan E. coli celler att avge ljus. Undvika quorum sensing förordning och icke-standardiserade tillväxt villkorar är betydande fördelarna med detta system.
Fördelarna med att använda Gibson kloning strategi är lätt montering av flera linjära DNA-fragment, hög flexibilitet och inget behov av särskilda begränsningar platser18,19,20. Denna metod kan enkelt ändra en lux operon, exklusive enskilda gener eller gen kluster eller att införa nya gener eller utbyte av gener från en stam med en annan. En förutsättning för tillämpning av denna metod är tillgången på de respektive lux operon gensekvensen. Endast för ett litet antal av självlysande bakterier är den fullständiga DNA-sekvensen av den respektive lux operon känd eller tillgänglig. Många av dessa sekvenser är fragmenterade eftersom de genererades med hjälp av shotgun sekvensering. När det gäller de undersökta P. mandapamensis 27561 komplett DNA-sekvensen av de lux operon är kända och tillgängliga från NCBI gen databasen (GenBank: DQ988878.2).
Ett kritiskt steg i protokollet av den Gibson församlingen är beräkningen av DNA koncentrationen av de enda fragment. I protokollet montering av tillverkaren det var rekommenderat att använda 0,2 – 0,5 pmols och en total volym på 20 µL för 4-6 fragment20,21. I vårt fall, där luxCDABFEG-ribEBH består av 4 fragment, var de koncentrationer och totala volymer 0,1 pmol 45 µL, respektive, beroende på avkastningen av PCR-produkter. Dels, koncentrationen hade minskas och å andra volymen hade ökas. Dock församlingen fungerat mycket bra och DNA-sekvensering bekräftade den korrekt insättning vid första försöket. Detta konstaterande bekräftas Gibson församlingen som en robust och lämplig metod för våra undersökningar, som lätt kan modifierade18,19,20.
Nyinrättade plate reader analysen är en lätthanterlig metod. Det möjliggör en enkel primär analys av nya eller (un-) känd självlysande bakteriestammar och ger redan en första ledtråd på den reglerande mekanismen för lätt produktion (t.ex. eftersläpning i luminiscens vid lågt tätheter). Tillväxt villkorar i kombination med lätt produktion kan dessutom enkelt utvärderas genom att helt enkelt ändra odlingsmedium eller temperatur.
Mätningarna med plattan läsaren utfördes vid 28 ° C. Anledningen till denna ovanlig inställning är temperatur känslighet självlysande bakteriestammar, där temperaturer över 30 ° C leder till mindre eller ingen tillväxt eller ljusöppningen. Observera att plattan läsaren är kapabel att hålla en definierad temperatur över tiden med begränsning av en saknas aktiva kylsystem. Därför måste omgivningstemperaturen vara under temperaturen för mätningen.
Som ett proof of concept, en jämförelse av den E. coli konstruktionen med självlysande stam P. mandapamensis (figur 5) å ena sidan och de hänvisar till mätningarna (figur 4) å andra sidan utfördes och bekräfta tillförlitligheten i detta nystartade system. Dessutom säkra långsiktig mätning livslängden på ljusöppningen (figur 6). Men måste man överväga att OD-värdena inte är tillförlitliga ovan en vissa optiska densitet, beroende på egenskaperna hos den begagnade mätinstrument (ca 15 h i förevarande fall) där en lämplig utspädning skulle behövas för en mätning i den linjär utbud av detektorn. Dessa höga varians i OD-värdena göra dessa länge mätningar inte tillförlitlig. Därför rekommenderas kortare mätningar såsom 10 h med experimentella setup redovisas här.
Begränsningar av etablerade plate reader analysens kan ses i figur 7. Svårigheten är att hitta en lämplig inställning av mätningen. Den ‘få värdet’ justerar känsligheten av foto multiplikator röret (PMT). Vinsten är förstärkning av signalen till den betalning, vilket innebär att en högre vinst faktor kommer att öka signalen. Om vinsten är för lågt inställd, signal-brusförhållande blir större ljus intensitet av ”låg” lysande självlysande bakterier inte kan mätas någon mer (signaler nära noll, inga data anges). Utmaningen i en självlysande analysen är att ställa in känsligheten så mätresultaten för alla bakteriestammar bo inom spänna av instrumentet. Dessutom mätområdet för Luminiscens beror på mätning intervalltiden (t.ex. högst 2.000.000 för 1 s).
Vinsten var inställd på 2800, som empiriskt testades och valt för specifika plattan läsaren används för upprättandet av denna metod. Används känslighetsinställningen tillåter inspelning av maximala avgivna ljuset genom den självlysande E. coli system, P. mandapamensis 27561 och P. mandapamensis S1 utan ett överflöd, men för stammar P. mandapamensis TH1 och V. harveyi 14126 vinsten var för hög. Därför dessa sistnämnda stammar överstiger gränsen för upptäckt och den verkliga maximal ljusintensiteten kan inte mätas. Denna tekniska begränsning kan hindra jämförelse av självlysande bakterier, som visar hög variationer i maximal ljusöppningen, även om tillväxten villkorar och cell tätheter kan vara jämförbara.
Positionering av de analyserade bakteriestammar inom de används plattorna har utvärderas empiriskt. Även om svarta plattor med glas bottnar användes, observerades överhörning mellan proverna. Ljusintensiteten för särskilda stammar är så hög, att alla närliggande brunnar kommer att Visa falskt positivt ljus utsläpp (t.ex. tomt). Det är därför viktigt att mäta två olika stammar antingen separat eller med en viss rumsliga separation till varandra.
Det finns redan många modifierade E. coli -stammar känt som innehåller delar av de lux operon och är främst tillämpningsnära15,16,17. Metoderna som beskrivs här, sikta på grundforskning, till exempel möjligheten att analysera varje lux gen separat. Även om forskning av Mareld har en lång historia, finns det fortfarande många öppna frågor. Genom exklusive införa gener från de lux operon, utbyta de luxAB -generna med gener från en annan stam eller analysera protein komplex, inbäddade i den lätthanterlig E. coli systemet och ytterligare tillämpning av plattan läsaren assay, kan det vara möjligt att få mer information om rättsliga processer och funktioner i lux gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) för hans stöd i upprättandet av egenskrivna skriptet för plattan läsaren. Detta arbete stöds av österrikiskt ”Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) till PM (P24189) och forskarutbildningen ”DK molekylär Enzymologi” (W901) till PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |