Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans
Summary
Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.
Abstract
Dans ce protocole, une protéine de fusion de protéine (GFP) fluorescence verte et 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration sont utilisés pour suivre les changements de localisation subcellulaire de protéine ; en particulier, une translocation nucléaire sous une chaleur stress condition. Les protéines réagissent signaux proportionnellement aux internes et externes. Un mécanisme commun est de changer sa localisation subcellulaire. Cet article décrit un protocole afin de suivre la localisation des protéines qui ne nécessite pas un anticorps, marquage radioactif ou un microscope confocal. Dans cet article, GFP est utilisé pour marquer la protéine cible EXL-1 chez c. elegans, un membre de la famille de protéines (CLICs) intracellulaire canal chlorure, y compris les mammifères CLIC4. Une lignée transgénique intégré translationnelle exl-1::gfp (avec un promoteur et une séquence de gène complet) a été créée par la transformation et le rayonnement γ et stablement exprime le gène et la gfp. Des recherches récentes ont montré que, lors de stress thermique, stress oxydatif pas, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau. Chevauchement avec la structure des noyaux et le DAPI, le signal de GFP signaux confirme les changements de localisation sous-cellulaire EXL-1 sous contrainte. Ce protocole présente deux méthodes différentes de fixation pour la coloration DAPI : fixation de l’éthanol et la fixation de l’acétone. Le protocole de coloration DAPI présenté dans cet article est rapide et efficace et préserve aussi bien le signal de la GFP et les changements de localisation sous-cellulaire des protéines. Cette méthode nécessite seulement un microscope à fluorescence avec Nomarski, un filtre FITC et un filtre DAPI. Il est adapté pour le petit laboratoire, étudiant en Master recherche, recherche étudiant de lycée et classes de biotechnologie.
Introduction
Un changement de localisation subcellulaire des protéines est un mécanisme commun en réponse aux signaux internes ou externes, tels que le stress thermique, famine, stress oxydatif, l’apoptose, la phosphorylation des protéines et d’autres. Par exemple, un stress thermique induit un membre FOXO DAF-16 translocation nucléaire1,2et la protéine BCL-2 pro-apoptotiques que BID translocation vers les mitochondries à mort récepteur signalisation3,4. Il existe plusieurs techniques détecter ces changements. Une combinaison de western blot et biochimiquement isoler des structures subcellulaires (p. ex., les mitochondries ou les noyaux) pourrait bien atteindre l’objectif3. Cependant, elle nécessite un anticorps spécifique contre la protéine d’intérêt. Ainsi, un anticorps bien établi devient la clé de la réussite. Une autre approche consiste à étiqueter les différentes structures subcellulaires ou organites avec des marqueurs différents tels que la protéine de fluorescence verte (GFP), protéine de fluorescence rouge (DP), protéine de fluorescence jaune (YFP) et mCherry et l’étiquette dans le même temps la protéine de intérêt avec les autres marqueurs. Ensuite, les observer sous un microscope confocal de localiser les cibles5,6. Isotopes radioactifs sont une alternative de choix pour l’étiquetage des protéines cibles et détection puis leur localisation subcellulaire7. Toutefois, cette méthode requiert une formation adéquate et la gestion des déchets radioactifs. Dans des circonstances telles que l’absence d’un anticorps spécifique, l’absence d’un bon marqueur, ou le manque d’équipement, comme un microscope confocal, une autre approche doit être examinée. Pour identifier une translocation nucléaire de protéine, il est attirant pour marquer uniquement les protéines cibles avec un marqueur et pour colorer les noyaux avec le réactif chimique 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) puisqu’il suffit d’un microscope à fluorescence ordinaire.
Immunomarquage c. elegans avec des anticorps est un défi en raison de la faible perméabilité de la cuticule de collagène qui entourent l’animal ou la coquille de l’oeuf. Pendant ce temps, étant donné que les protéines de c. elegans sont significativement différentes des leurs orthologues vertébrés, quelques sociétés commerciales fournissent c. elegans avec des produits spécifiques. Il est difficile pour un petit laboratoire à produire des anticorps de c. elegans pour eux-mêmes. Chercheurs dans la communauté utilisent souvent les protéines étiquetées comme marqueurs pour démontrer une expression de localisation ou de gène de protéine. Cet article utilise EXL-1::GFP par exemple pour suivre une translocation nucléaire de protéines sous stress de chaleur8. Une translation intégré exl-1::gfp dans le génome de l’animal sert à stablement expriment le gène de fusion de gfp . Recherche a montré que exl-1 est exprimé dans l’intestin, muscle de la paroi corporelle et autres structures subcellulaires8. Ce protocole montre comment synchroniser vers le quatrième stade larvaire (L4), effectuer une chaleur stress experiment et conduite coloration DAPI, éthanol de fixation, fixation de l’acétone et l’imagerie sous un microscope à fluorescence ordinaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente une méthode rapide et efficace pour vérifier les modifications subcellulaire protéique du cytoplasme au noyau. L’expression de la protéine a été montrée par une fusion de GFP, tandis que la structure du noyau a été vérifiée par DAPI coloration (Figure 3). Immunomarquage c. elegans protéines étant difficile, la plupart localisations subcellulaires de la protéine c. elegans sont caractérisées par leur marquage avec des protéines de mar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les souches de c. elegans utilisées dans cette étude ont été obtenues depuis le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est soutenu par le National Institutes of Health – programmes d’Infrastructure du Bureau de la recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par les NIH : 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-groupe 1501 à Jun Liang et CFP-CUNY 66184-00 44 et 45/67248-00 Jun Liang. Cathy Savage-Dunn nous remercions de bien vouloir partager son espace de laboratoire. Toutes les images de fluorescence ont été perçus au Queens College Core Facility. Nous remercions William J. Rice pour ses commentaires sur le manuscrit.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
Referências
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