Att upptäcka Protein subcellulär lokalisering av grönt fluorescerande Protein taggning och 4', 6-diamidin-2-fenylindol färgning i Caenorhabditis elegans
Summary
Detta protokoll visar hur att spåra en protein translokationen i cellkärnan under värmestress med hjälp av ett grönt fluorescerande protein (GFP)-fusionsprotein som markör och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning. Den DAPI färgning protokoll är snabb och bevarar god Jordbrukarsed och protein subcellulär lokalisering signalerna.
Abstract
I detta protokoll, ett grönt fluorescerande protein (GFP) fusionsprotein och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning används för att spåra protein subcellulär lokalisering ändringar; i synnerhet betona en translokationen i cellkärnan under en värme skick. Proteiner reagerar på motsvarande sätt till externa och interna signaler. En gemensam mekanism är att ändra dess subcellulär lokalisering. I artikeln beskrivs ett protokoll för att spåra protein lokalisering som inte kräver en antikropp, radioaktiv märkning eller confocal Mikroskop. I den här artikeln används GFP att tagga målproteinet EXL-1 i C. elegans, en medlem av familjen klorid intracellulära kanal proteiner (klickar), inklusive däggdjur CLIC4. En integrerad translationell exl-1::gfp transgena linje (med en promotor och en full gensekvens) skapades av omvandling och γ-strålning och uttrycker stabilt genen och god jordbrukarsed. Ny forskning visade att vid värmestress, inte oxidativ stress, EXL-1::GFP ackumuleras i kärnan. Överlappande GFP signalen med både kärnor strukturen och DAPI signaler bekräftar EXL-1 subcellulär lokalisering ändringarna under stress. Detta protokoll presenterar två olika fixering metoder för DAPI färgning: etanol fixering och aceton fixering. DAPI färgning protokollet presenteras i denna artikel är snabb och effektiv och bevarar både GFP signalen och protein subcellulär lokalisering ändringarna. Denna metod kräver endast ett fluorescens Mikroskop med Nomarski, en FITC-filter och ett DAPI filter. Den är lämplig för små laboratoriemiljö, grundutbildningsprogram student forskning, high school student forskning och bioteknik klassrum.
Introduction
En förändring av protein subcellulär lokalisering är en gemensam mekanism som svar på inre eller yttre signaler som värmestress, svält, oxidativ stress, apoptos, protein fosforylering och andra. Till exempel inducerar värmestress medlem FOXO DAF-16 translokationen i cellkärnan1,2och pro-apoptotiska BCL-2 proteinet bud translocates till mitokondrierna vid mottagande död signalering3,4. Det finns olika tekniker att upptäcka dessa ändringar. En kombination av western blotting och biokemiskt isolera subcellulära strukturer (t.ex., mitokondrier eller atomkärnor) kunde väl uppnå mål3. Det kräver dock en specifik antikropp mot proteinet av intresse. Således blir en väletablerad antikropp nyckeln till framgång. En alternativ metod är att märka olika subcellulära strukturer eller organeller med olika markörer såsom grönt fluorescerande protein (GFP), röd fluorescens protein (RFP), gul fluorescens protein (YFP) och mCherry, och under tiden märka proteinet av intresse med andra markörer. Sedan Följ dem under en confocal Mikroskop för att lokalisera mål5,6. Radioaktiva isotoper är ett alternativt val för märkning målproteiner och sedan upptäcka deras subcellulär lokalisering7. Denna metod kräver dock ordentlig utbildning och hantering av radioaktivt avfall. Under sådana omständigheter som avsaknaden av en specifik antikropp, frånvaron av en ordentlig markör, eller Scarcenessen av utrustning såsom confocal Mikroskop måste ett alternativt tillvägagångssätt övervägas. För att identifiera en protein translokationen i cellkärnan, är det attraktivt att bara märka målproteiner med en markör och färga atomkärnor med kemiska reagens 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eftersom detta endast kräver regelbunden fluorescens Mikroskop.
Immunolabeling C. elegans med antikroppar är utmanande på grund av den låga permeabiliteten av antingen äggskalet eller kollagena nagelbanden kring djuret. Under tiden, eftersom C. elegans proteiner är signifikant skilda från deras ryggradsdjur orthologs, ge några kommersiella företag C. elegans med specifika produkter. Det är svårt för ett litet laboratorium att generera C. elegans antikroppar för sig själva. Forskare inom gemenskapen använder ofta märkta proteiner som markörer för att demonstrera ett protein lokalisering eller gen uttryck. Denna artikel använder EXL-1::GFP som ett exempel för att spåra en protein translokationen i cellkärnan under värme stress8. En integrerad translationell exl-1::gfp in djur genomet används stabilt uttrycka genen med gfp fusion. Forskning visade att exl-1 uttrycks i tarmen, kroppen väggen muskler och andra subcellulära strukturer8. Detta protokoll visar hur synkronisera maskar till den fjärde larvstadium (L4), utföra en värme stress experiment och beteende DAPI färgning, etanol fixering, aceton fixering och imaging i regelbundna fluorescens Mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln presenteras en snabb och effektiv metod för att verifiera protein subcellulär ändringar från cytoplasman till kärnan. Proteinuttryck visades av en god Jordbrukarsed fusion, medan kärnan strukturen kontrollerades av DAPI färgning (figur 3). Eftersom immunfärgning C. elegans proteiner är utmanande, de flesta C. elegans protein subcellulär lokaliseringar kännetecknas genom att tagga dem med markör proteiner som GFP, Laz, mCherry och andra<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans stammar används i denna studie erhölls från stadens Caenorhabditis genetik, som stöds av den National Institutes of Health – Office av infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöds av NIH: 1R03AG048578-01 till Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 till Jun Liang och PSC-CUNY 66184-00 44 och 67248-00 45 till Jun Liang. Vi tackar Cathy Savage-Dunn för vänligen dela hennes laboratorium utrymme. Alla fluorescens bilder samlades på Queens College Core Facility. Vi tackar William J. Rice för hans synpunkter på manuskriptet.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
Referências
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genética. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
