Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação
Summary
Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.
Abstract
Células-tronco pluripotentes humanas ingênuo (N-hPSC) com funcionalidade aprimorada pode ter um impacto grande em medicina regenerativa. O objetivo do presente protocolo é eficientemente reverter células-tronco pluripotentes humanas linhagem-aprontadas, convencional (hPSC) mantidas em condições alimentador-livre ou dependente do alimentador para uma ingênuo como pluripotência com funcionalidade aprimorada. Este método de reversão química ingênuo emprega o fator de inibição clássica leucemia (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibição cocktail (LIF-2i), suplementado com apenas um inibidor de tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverte hPSC convencional para um estado estável pluripotentes adotando transcriptional, bioquímicos e epigenéticas características do humano pré-implantação epiblasto. Este método de LIF-3i requer manipulação de cultura celular mínima e é altamente reprodutível em um amplo repertório de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e linhas de células-tronco (hiPSC) isento de transgene humano pluripotentes induzidas. O método de LIF-3i não requer uma etapa re-escorvamento antes a diferenciação; N-hPSC podem ser diferenciados diretamente com altíssima eficiência e manter espectofotômetro e estabilidades de epigenomic (incluindo em loci imprinted). Para aumentar a universalidade do método, hPSC convencional primeiro são cultivadas no coquetel de LIF-3i suplementado com duas pequenas moléculas adicionais que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) sinalização (LIF-5i). Nesta etapa de adaptação LIF-5i breve significativamente aumenta a expansão clonal inicial do hPSC convencional e permite que eles sejam posteriormente ingênuo-revertido com LIF-3i sozinho em grandes quantidades, assim obviating a necessidade para colheita/subcloning raro N-hPSC colónias mais tarde. LIF-5i-estabilizado hPSCs são mantidos posteriormente no LIF-3i sozinhos sem a necessidade de moléculas anti-apoptotic. O mais importante, LIF-3i reversão marcadamente melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de hPSC convencional diminuindo sua expressão de gene linhagem-aprontadas e apagando a interlinha variabilidade de diferenciação dirigida comumente observada entre linhas hPSC independente. Caracterizações representativas de LIF-3i-revertido N-hPSC são estratégias fornecidas e experimentais para comparações funcionais do hPSC isogénicas na linhagem-aprontadas vs. ingênuo, como Estados são descritos.
Introduction
O sistema de cultura 2i (inibidor de MEK/ERK e GSK3β) foi originalmente desenvolvido para refinar a culturas de células-tronco embrionárias (mESC) heterogêneo baseado em soro mouse a um estado de solo uniforme de pluripotência parecido com o rato epiblasto pré-implantatório1. No entanto, 2i não oferece suporte a manutenção estável de pluripotentes humanas de linhas de células-tronco (hPSC)2. Os vários pequena molécula complexa, fator de crescimento-completada e abordagens transgênicas recentemente têm sido relatados para capturar presumidamente semelhante humano ingênuo como pluripotentes molecular afirma2. No entanto, muitos dos Estados “ingênua, como” criados com estes métodos também exibiram espectofotômetro instabilidade, epigenomic defeitos (por exemplo, global perda do imprinting genômico parental), ou com deficiências potenciais de diferenciação.
Em contraste, o coquetel de triplo inibição química da GSK3β, ERK e tankyrase sinalização e fator inibitório de leucemia (LIF-3i) foi suficiente para a reversão de ingênuo, como estável de um amplo repertório de hPSC convencional linhas3. LIF-3i-revertido ingênuo hPSC (N-hPSC) mantido cariótipos normais e aumentou suas expressões de genes específicos ingênuo humano pré-implantação epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC de reversão também conferido com uma matriz de características moleculares e bioquímicas únicas de pluripotência mESC-como ingênua que incluiu sinalização aumento de STAT3 fosforilada, diminuição da fosforilação de ERK, global 5-metilcitosina CpG hypomethylation, desmetilação de CpG todo o genoma em células-tronco embrionárias (ESC)-promotores de genes específicos e dominante uso de intensificador de OCT4 distal. Além disso, em comparação com outro ingénuo métodos de reversão que resultaram em aberrantly hypomethylated impresso loci genômicos, N-hPSC LIF-3i-revertido fosse desprovido de perda sistemática de padrões impressos de CpG ou perda de expressão de DNA metiltransferase (por exemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Uma cultura de LIF-3i directa de um vasto leque de convencionais células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC) cultivadas em alimentadores ou E8 alimentador-free condições alcançado reversão rápida e do volume para um estado de epiblasto ingênuo. No entanto, direto LIF-3i ingênuo reversão pode ser ineficiente em algumas linhas hPSC convencional instável devido as inerentes variabilities genômicas e linhagem-aprontadas decorrentes as origens de doador geneticamente diversas.
Assim, para ampliar a utilidade do método LIF-3i, uma otimização gradual foi desenvolvida e é apresentada neste documento, que permite reversão ingênuo universal com quase qualquer hESC convencional ou hiPSC transgene-free linha cultivadas em alimentadores. Este método de reversão ingênuo universalizada emprega uma etapa transitória cultura inicial no hPSC convencional que complementa o coquetel LIF-3i com dois adicionais pequenas moléculas (LIF-5i) que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) ( sinalização de purmorphamine). Uma passagem inicial do hPSC convencional no LIF-5i adapta-los para posterior reversão de LIF-3i estável em grandes quantidades. Adaptação de LIF-5i inicial aumenta significativamente a proliferação clonal inicial única célula do hPSC convencional cultivada em E8 ou alimentadores (antes da sua passagem estável, contínua subsequente no LIF-3i sozinho). Linhas hPSC convencional adaptadas primeiro para uma passagem no LIF-5i toleram granel subsequente clonal passagem de células ingênuo-revertido em condições de LIF-3i, que elimina a necessidade de escolher e subcloning de raras colônias estáveis, ou o uso rotineiro de anti-apoptotic moléculas ou inibidores de Rho-associada a proteína quinase (ROCK).
O método de LIF-3i tem sido empregado com sucesso estàvel expandir e manter um amplo repertório de > 30 linhas independentes, geneticamente diversa hPSC convencional para > passagens de 10 a 30 usando qualquer um dos métodos enzimáticos ou não enzimáticos dissociação, e sem evidência de indução de cromossômica ou anormalidades epigenomic, incluindo anormalidades em loci imprinted gene. Além disso, sequencial cultura LIF-5i/LIF-3i é o ingênuo única reversão método que até agora tem sido relatado que melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de linhas convencionais hPSC, diminuindo sua expressão de gene linhagem-preparado e melhorar drasticamente a sua potência de diferenciação multipotentes. O LIF-3i ingênuo reversão método supressão inerente interline variabilidade de diferenciação das linhas hPSC linhagem-aprontadas, convencional e terá uma grande utilidade de aplicação na medicina regenerativa e terapias celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema de LIF-3i aplica-se uma versão modificada do clássico 2i murino ingênuo reversão cocktail1 a células estaminais pluripotentes humanas. A auto-renovação do hPSC (que não pode expandir em 2i sozinho) é estabilizada no LIF-2i, completando este cocktail com o inibidor de tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permite a granel e reversão eficiente do hPSC convencional para um estado de pluripotentes, lembrando o epiblasto pré-implantatório humano<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH/NEI (R01EY023962), NIH/FORMULADORES (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk prêmio Fórum de ciência e a Fundação de Moseley.
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referências
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