Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.
Las ingenuo (N-hPSC) células madre pluripotentes humanas con la funcionalidad mejorada puede tener un gran impacto en medicina regenerativa. El objetivo de este protocolo es volver eficaz pluripotent humana convencional, preparado por el linaje de células (hPSC) mantenidas en condiciones libre de alimentador o feeder-dependiente a una pluripotencia ingenua-como con la funcionalidad mejorada. Este método de reversión química ingenuo emplea el factor inhibidor de leucemia clásica (LIF), GSK3β y MEK/ERK inhibición cóctel (LIF-2i), complementado con un inhibidor de tankirasa XAV939 (LIF-3i). LIF-3i vuelve hPSC convencional a un estado pluripotente estable adoptando transcripcional, bioquímicos y características epigenéticas del epiblasto antes de la implantación humana. Este método de LIF-3i requiere manipulación de la cultura de célula mínima y es altamente reproducible en un amplio repertorio de células madre embrionarias humanas (hESC) y líneas de células madre (hiPSC) libre de transgén de humanas pluripotentes inducidas. El método LIF-3i no requiere un paso re cebado antes de la diferenciación; N-hPSC pueden diferenciarse directamente con eficacias extremadamente altas y mantener karyotypic y epigenómica estabilidades (incluso de loci impresos). Para aumentar la universalidad del método, en el cóctel de LIF-3i complementado con dos pequeñas moléculas adicionales que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y erizo sónico (sHH) (purmorphamine) señalización (LIF-5i) se cultivan primero hPSC convencional. Esta breve etapa de adaptación de LIF-5i significativamente mejora la inicial expansión clonal de hPSC convencional y permite que posteriormente volvieron a ingenuos con LIF-3i solo en grandes cantidades, así evitando la necesidad de picking/subcloning raro N-hPSC colonias más adelante. HPSCs LIF-5i-estabilizado se mantienen posteriormente en LIF-3i solos sin necesidad de moléculas anti-apoptóticas. Lo más importante, reversión de LIF-3i mejora notablemente la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de hPSC convencional disminuyendo su expresión de gen de cebada de linaje y borrando la variabilidad interlineal de diferenciación dirigida comúnmente observado entre líneas hPSC independiente. Caracterizaciones representativas de LIF-3i-revertir N-hPSC son estrategias proporcionadas y experimentales para comparaciones funcionales de hPSC isogénicas en linaje cebada vs. ingenua-como Estados se contornean.
El sistema de cultivo 2i (inhibidor de la MEK/ERK y GSK3β) fue desarrollado originalmente para refinar las culturas de las células madre embrionarias (mESC) heterogéneos basados en suero del ratón a un estado uniforme de pluripotencialidad similar al epiblasto preimplantacional de ratón1. Sin embargo, 2i no es compatible con el mantenimiento estable de humanas pluripotentes células madre (hPSC) líneas2. Los distintos compleja molécula pequeña, suplementada con factor de crecimiento y enfoques transgénicos se han divulgado recientemente para capturar supuestamente similar ingenua-como pluripotent humana molecular Estados2. Sin embargo, muchos de los Estados “ingenua-como” creados con estos métodos también exhibieron inestabilidad cariotípica, epigenómica defectos (por ejemplo, pérdida global de impresión genómica parental), o con problemas potenciales de diferenciación.
En contraste, el cóctel de triple inhibición química de la GSK3β, ERK y tankirasa señalización y factor inhibidor de leucemia (LIF-3i) era suficiente para la reversión estable de ingenua-como de un amplio repertorio de hPSC convencionales líneas3. LIF-3i-vuelto ingenuo hPSC (N-hPSC) mantiene los karyotypes normales y aumentado sus expresiones de genes específicos de ingenuo humano preimplantacional epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i reversión también conferida hPSC con una serie de características moleculares y bioquímicas únicas a pluripotencia mESC-como ingenua que incluyó mayor señalización de STAT3 fosforilados, disminución de la fosforilación de ERK, global de 5-METILCITOSINA CpG La hipometilación, desmetilación de CpG de genoma en células madre embrionarias (ESC)-promotores de genes específicos y el uso de potenciador de OCT4 distal dominante. Además, en comparación con otros ingenuos métodos de reversión que aberrantemente hypomethylated imprimieron loci genómicos, revertido por LIF-3i N-hPSC fueron sin pérdida sistemática de patrones de CpG impresos ni pérdida de expresión de ADN metiltransferasa (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Una cultura de LIF-3i directa de una amplia gama de células de vástago embrionarias humanas convencionales (hESC) y células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) crecidas en comederos o en condiciones libres de alimentador de E8 logra reversión rápida y a granel a un ingenuo epiblasto-como estado. Sin embargo, directo LIF-3i ingenuo reversión puede ser ineficaz en algunas líneas de hPSC convencional inestable debido a las inherentes variabilidades genómicas y linaje preparado derivados de los fondos de donantes genéticamente diversas.
Así, para ampliar la utilidad del método LIF-3i, una optimización paso a paso fue desarrollada y se presenta en este documento, que permite la reversión ingenuo universal con casi cualquier hESCs convencional o libre de transgén hiPSC línea cultivados en alimentadores. Este método de reversión del ingenuo universalizado emplea un paso de la cultura inicial transitoria en hPSC convencional que complementa el cóctel de LIF-3i con dos adicionales pequeñas moléculas (LIF-5i) que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y (sonic hedgehog (sHH) señalización de purmorphamine). Un paso inicial de hPSC convencional en LIF-5i adapta a posterior reversión de LIF-3i estable en grandes cantidades. Adaptación de LIF-5i inicial aumenta significativamente la proliferación clonal de la célula inicial de hPSC convencional en E8 o alimentadores (antes de su paso posterior estable, continuo en LIF-3i solo). Líneas convencionales hPSC adaptadas primero a un pasaje de LIF-5i toleran posterior a granel clonal pases de ingenuo revertir células en condiciones de LIF-3i, que evita la necesidad de escoger y subcloning de las colonias estables raras, o el uso rutinario de moléculas anti-apoptóticas o los inhibidores de la proteína Rho quinasa (ROCK).
El método LIF-3i ha sido empleado con éxito para ampliar estable y mantener un amplio repertorio de > 30 hPSC convencional independiente, genéticamente diversas líneas para > 10 – 30 pasos utilizando cualquiera de los dos métodos de disociación enzimática o no enzimática, y sin evidencia de inducción de cromosómicas o anomalías epigenómica, incluyendo anormalidades en lugares geométricos del gene impreso. Además, cultura de LIF-5i/LIF-3i secuencial es el método de reversión sólo ingenuo que hasta el momento se ha reportado que mejora la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC disminuyendo su expresión del linaje cebada gen y dramáticamente mejorar su potencia de diferenciación multipotentes. La borra de ingenuo reversión método de LIF-3i la inherente variabilidad de la diferenciación de líneas hPSC convencional, preparado por el linaje de la interlínea y tendrá una gran utilidad de aplicación en medicina regenerativa y terapias celulares.
El sistema de LIF-3i aplica una versión modificada del clásico 2i murino ingenuo reversión cóctel1 a células madre pluripotentes humanas. La auto renovación de hPSC (que no se puede expandir en 2i solo) se estabiliza en LIF-2i por complementar este cocktail con el inhibidor de tankirasa XAV939. LIF-3i cultura permite a granel y eficiente reversión de la hPSC convencional a un estado pluripotente que se asemeja el epiblasto preimplantacional humana3…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por becas del NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein innovación, el fondo de investigación de la célula de vástago Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk ciencia Foro premio y la Fundación de Moseley.
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
CF1 mouse | Charles river | 023 | |
CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |