वीवो में नवजात चूहों में टेम कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता का आकलन करने के लिए बृहदांत्र में कोशिकाओं की Photolabeling
Summary
प्रोटोकॉल यहां वर्णित नवजात चूहों में एक photolabeling दृष्टिकोण का इस्तेमाल विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि बृहदांत्र से अतिरिक्त आंत्र साइटों के लिए बसने की पहचान । इस रणनीति के शुरुआती जीवन में मेजबान-microbiome बातचीत का अध्ययन उपयोगी होगा.
Abstract
दर्जी बैक्टीरियल समुदायों के जीवन में जल्दी स्थापित कर रहे है और प्रभाव प्रतिरक्षा सेल विकास और समारोह । नवजात microbiota एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग और आहार है, जो स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों के लिए संवेदनशीलता प्रभावों सहित कई बाहरी प्रभावों के लिए अतिसंवेदनशील है । इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) के रूप में विकारों आंतों के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विशाल आमद की विशेषता है । हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिकाओं microbiota द्वारा वातानुकूलित अतिरिक्त आंतों साइटों पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए आंतों से बाहर बसने हो सकता है. इस प्रकार, वहां की पहचान करने और कोशिकाओं है कि आंतों से माइक्रोबियल संदेश बाहर की साइटों के लिए ले जा सकता है की विशेषता है । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए vivo में नवजात चूहों के बृहदांत्र में कोशिकाओं लेबल है कि प्रवास के बाद अतिरिक्त आंत्र साइटों पर उनकी पहचान को सक्षम बनाता है ।
Introduction
स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग बैक्टीरिया है कि मेजबान1के साथ एक सहजीवी संबंध में मौजूद की प्रजातियों के सैकड़ों बंदरगाह । स्थानीय वातावरण में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं इन रोगाणुओं के साथ एक शांतिपूर्ण सह-अस्तित्व लागू करने और रोगज़नक़ हमलों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक बाधा स्थापित । इस प्रकार, द्वि-प्रतिरक्षा कोशिकाओं और microbiota के बीच दिशात्मक बातचीत के लिए एक खाना खानेवाला समुदाय है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को शिक्षित और रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा जेट के लिए दहलीज सेट स्थापित महत्वपूर्ण हैं । माइक्रोबियल संरचना में परिवर्तन, या dysbiosis, प्रतिरक्षा homeostasis और perturb विनियामक सर्किट परेशान कर सकते है कि आंतों की सूजन जैसे प्रकार के रूप में प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोगों के लिए प्रमुख 1 मधुमेह और आईबीडी2,3 .
जंम के तुरंत बाद की अवधि एक अनूठा विकास खिड़की है जिसके दौरान आंतों माइक्रोबियल समुदायों को एक ही समय में स्थापित करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के4परिपक्व शुरू होता है । जन्मोत्तर microbiota स्थिर नहीं है, समुदाय संरचना में बदलाव के साथ स्वाभाविक रूप से और5बार होने वाली । प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि microbiota के साथ बातचीत आंत में दो विशिष्ट संरचनात्मक स्थानों में रहते हैं- लेमिना propria और आंत्र उपकला6. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई प्रकार (जैसे टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं के रूप में) के रूप में अच्छी तरह से माइलॉयड कोशिकाओं (जो वृक्ष कोशिकाओं, monocytes, और मैक्रोफेज शामिल हैं) के रूप में लिम्फोसाइटों सहित आंत में मौजूद हैं । इन कोशिकाओं को भी टेम कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है, कार्यों की एक भीड़ है कि आंतों बाधा को बनाए रखने और homeostasis का रखरखाव करते हैं ।
आंतों साइटों पर अपने विनियामक कार्यों के अलावा, श्लेष्मा की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी अतिरिक्त आंत्र साइटों के लिए माइक्रोबियल संदेश ले जा सकता है प्रणालीगत प्रतिरक्षा7,8,9को विनियमित । यह अनुसंधान के बढ़ते हित का एक क्षेत्र है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि आंतों के ऊतकों से बाहर पलायन की पहचान करने के लिए तरीकों की जरूरत पर प्रकाश डाला गया ताकि उनके समारोह की जांच करने के लिए । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस मॉडल जिसमें एक photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कोशिकाओं लेबल का दोहन किया जाता है का उपयोग करता है । फामआबकारी चूहों बैरे एक हरी फ्लोरोसेंट Dendra2 प्रोटीन है कि अचल पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश10द्वारा सक्रियण पर लाल प्रतिदीप्ति के लिए बंद है व्यक्त करते हैं । एक फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी का उपयोग करने के लिए नवजात चूहों के बृहदांत्र में ४०५ एनएम प्रकाश देने के लिए, हम प्रदर्शन करते है कि photoconverted टेम कोशिकाओं है, जो में उत्पंन किया है या बृहदांत्र के माध्यम से पारगमन तिल्ली में पाया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पहचान और कोशिकाओं है कि के साथ बातचीत और बृहदांत्र में microbiota से प्रभावित है के लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है और श्लैष्मिक microenvironment से कैसे जानकारी शरीर के आराम करने के लिए relayed है की समझ की सुविधा होनी चाहिए । आं?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नित्यकर्म जैन को एक NIH/NIAID कैरियर संक्रमण पुरस्कार 1K22AI116661-01 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Outro | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Referências
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