Protokollen beskrevet her benytter en photolabeling tilnærming i nyfødte mus å identifisere spesifikt immunceller som emigrere fra kolon ekstra intestinal områder. Denne strategien vil være nyttig å studere vert-microbiome interaksjoner i tidlige liv.
Innstigning bakteriell samfunn er etablert tidlig i livet og påvirke immun celle utvikling og funksjon. Neonatal bakterieflora er utsatt for mange ytre påvirkninger inkludert antibiotika bruk og kosthold, som påvirker mottakelighet for autoimmune og inflammatoriske sykdommer. Lidelser som inflammatorisk tarm sykdom (IBD) er preget av en massiv tilstrømning av immunceller i tarmen. Imidlertid kan immunceller betinget av bakterieflora i tillegg emigrere av tarmen å påvirke immunreaksjoner på ekstra intestinal nettsteder. Dermed er det behov for å identifisere og karakterisere celler som kan bære mikrobiell meldinger fra tarmen til distale nettsteder. Her beskriver vi en metode til etiketten celler i tykktarmen nyfødte mus i vivo som gjør sin legitimasjon på ekstra intestinal nettsteder etter overføringen.
Pattedyr fordøyelsessystemet havner hundrevis arter av bakterier som finnes i et symbiotisk forhold med verten1. Immunceller i det lokale miljøet håndheve en fredelig sameksistens med disse mikrobene og etablere en beskyttende barriere mot patogen invasjoner. Dermed er toveis interaksjoner mellom immunceller og bakterieflora avgjørende for å etablere en commensal samfunn som utdanner immunsystemet verten og angir terskelen for immun reaktivitet til patogener. Mikrobiell sammensetning, eller dysbiosis, kan forstyrre immun homeostasis og forurolige regulatoriske kretser som holde intestinal betennelser som fører til immun-mediert sykdommer som Type 1 Diabetes og IBD2,3 .
Perioden umiddelbart etter fødselen er et unikt utviklingsmessige vindu der intestinal mikrobielle samfunn begynne å etablere samtidig immunsystemet modnes4. Postnatal bakterieflora er ikke stabil, med endringer i samfunnet sammensetningen forekommer naturlig og ofte5. Immunceller som samhandler med bakterieflora ligger i to forskjellige anatomiske steder i tarmen – lamina propria og intestinal epitel6. Det finnes mange typer immunceller i tarmen, inkludert lymfocytter (som T celler, B-celler og medfødte lymfoide celler) og myeloide celler (som omfatter dendrittiske celler, monocytter og makrofager). Disse cellene, også kjent som blodkreft cellene, utføre en rekke funksjoner som bevare intestinal barriere og opprettholde homeostase.
I tillegg til deres juridiske funksjoner på intestinal nettsteder kan immunceller mucosa også bære mikrobiell meldinger til ekstra intestinal steder å regulere systemisk immunitet7,8,9. Dette er et område av voksende forskningsinteresse fremhever behovet for metoder for å identifisere immunceller overføre av intestinal vev for å undersøke sin funksjon. Protokollen rapporterte her benytter en kommersielt tilgjengelig musemodell der en photoconvertible fluorescerende protein er utnyttet til etiketten celler. PhAMforbrukeravgift mus uttrykke overalt en grønn fluorescerende Dendra2 protein som er irreversibelt byttet til røde fluorescens ved aktivering av ultrafiolett (UV) lys10. Bruke en fiber optisk kanyle for å levere 405 nm lys inn i tykktarmen nyfødte mus, viser vi at photoconverted blodkreft cellene, som stammer fra eller passerte gjennom kolon kan bli funnet i milten.
Identifisering og karakterisering av celler som samhandler med og påvirkes av bakterieflora i tykktarmen er viktige og skal lette forståelsen av hvordan informasjon fra mucosal microenvironment videresendes til resten av kroppen. En metode for å studere gut-relaterte celle migrasjon krever isolering av gut-assosiert celler etterfulgt av en adopsjon overføring til mottakeren mus å bestemme sine vev-homing mønstre og funksjon12,13. Denne tilnærmingen er begr…
The authors have nothing to disclose.
Nitya Jain ble støttet av en NIH/NIAID karriere overgangen Award 1K22AI116661-01.
Laser | |||
Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
Intestinal cell isolation | |||
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
Single cell suspension | |||
Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
Antibodies | |||
BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
Outro | |||
Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |