Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste
Summary
Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.
Abstract
Enterik bakteri toplulukları erken yaşta kurulur ve bağışıklık hücre gelişimi ve işlevini etkiler. Yenidoğan microbiota antibiyotik kullanımı ve diyet, otoimmün ve inflamatuvar hastalıklara yatkınlık etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda dış etkilere maruz kalabilir. Bozuklukları inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi bağırsak için bağışıklık hücreleri büyük akını ile karakterizedir. Ancak, bağışıklık hücreleri tarafından microbiota şartına ayrıca bağışıklık yanıtı ekstra bağırsak sitelerdeki etkilemek için bağırsaklar dışarı göç. Böylece, tanımlamak ve bağırsak mikrobiyal iletilerden distal sitelere taşıyabilir hücreleri ayırdetmek için gerek yoktur. Burada, ekstra bağırsak sitelerde kimlik geçişten sonra sağlar yeni doğan fareler vivo içinde kolon etiket hücrelere bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Memeli gastrointestinal sistem ana makine1ile simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır bakteri türleri yüzlerce liman. Yerel ortamda mevcut bağışıklık hücreleri ile bu mikropların barışçıl kullanımını zorlayın ve patojen akınları karşı koruyucu bir bariyer oluşturmak. Böylece, bağışıklık hücreleri ve microbiota arasındaki çift yönlü etkileşimler ana bağışıklık sistemi eğitir ve patojenler için bağışıklık reaktivite eşiğini ayarlar komensal bir topluluk kurmak için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kompozisyon veya dysbiosis, can değişimler bağışıklık homeostazı rahatsız ve huzursuz bağırsak iltihapları2,3 tip 1 diyabet ve IBD gibi hastalıklar immün aracılı önde gelen dizginlemek düzenleyici devreler .
Sonra hemen Doğum sırasında aynı zamanda bağışıklık sistemini kurmak bağırsak mikrobiyal topluluklar başlar benzersiz bir gelişimsel pencere dönemi4olgunlaşır. Postnatal microbiota istikrarlı, vardiyalar halinde doğal olarak meydana gelen topluluk kompozisyon ve sık sık5ile değil. İki farklı anatomik konumda bağırsak – lamina propria ve bağırsak epitel6microbiota ile etkileşim bağışıklık hücreleri bulunur. Çeşitli tiplerde bağışıklık hücreleri lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve doğuştan gelen lenfoid hücre gibi) (hangi katmak dendritik hücreler, monosit ve makrofajlar) myeloid hücrelerin yanı sıra dahil bağırsak, mevcut. Bu hücreler, olarak da bilinen hematopoetik hücreler, çok sayıda bağırsak bariyer korumak ve homeostazı korumak işlevler gerçekleştirin.
Bağırsak siteleri kendi düzenleyici işlevlerine ek olarak, mukoza bağışıklık hücreleri sistemik dokunulmazlık7,8,9düzenleyen mikrobiyal iletileri ekstra bağırsak sitelere de taşıyabilir. Bu araştırma ilgi alanıdır ve onların işlevini prob için bağırsak dokusu dışında geçirmek bağışıklık hücreleri tanımlamak yöntemleri ihtiyacını vurgular. Rapor burada protokol photoconvertible floresan protein etiket hücrelere istismar edilir bir ticari olarak mevcut fare modeli kullanır. PhAMeksize fareler ubiquitously ultraviyole (UV) ışık10tarafından geri dönüşümsüz etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık yeşil bir floresan Dendra2 protein hızlı. Yeni doğan farelerin kolon 405 nm ışık sağlamak için fiber optik kanül kullanarak, kaynaklı veya kolon aktarıldığı photoconverted hematopoetik hücreler, dalak bulunabilir göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kimlik ve çalışabileceği ve bağırsaktaki microbiota etkilenmiştir hücrelerin karakterizasyonu önemlidir ve mukozal microenvironment bilgilerinden vücudun geri kalanına nasıl geçirilir anlayış kolaylaştıracaktır. Gut ile ilgili hücre geçiş çalışmak için bir yöntem yalıtımı gut ilişkili hücre tarafından evlat edinen bir transfer alıcı fareler onların doku-posta desenlerini belirlemek ve12,13işlev takip gerektirir. Aktarılan beli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain bir NIH/NIAID kariyer geçiş Ödülü 1K22AI116661-01 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Outro | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Referências
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
