Her præsenterer vi en protokol for kendetegner monocyt delmængder af fuldblod flowcytometri. Dette omfatter skitserer, hvordan gate delmængder og vurdere deres udtryk for celleoverflademarkører og giver et eksempel på vurdering af udtryk for M1 (inflammatoriske) og M2 markører (anti-inflammatoriske).
Monocytter er vigtige bidragydere i forskellige inflammatoriske lidelser og ændringer til disse celler, herunder deres delmængde proportioner og funktioner, kan have en patologisk betydning. En ideel metode til at undersøge ændringer af monocytter er fuldblod flowcytometri som minimal håndtering af prøver af denne metode begrænser kunstig celle aktivering. Dog træffes mange forskellige tilgange til gate monocyt delmængder fører til inkonsekvent identifikation af delmængder mellem undersøgelser. Her viser vi en metode ved hjælp af fuldblod flowcytometri at identificere og karakterisere humane monocyt delmængder (klassisk, mellemliggende og ikke-klassisk). Vi skitsere hvordan du forbereder blodprøverne til flowcytometri, gate delmængder (sikre kontaminerende celler er blevet fjernet) og bestemme monocyt delmængde udtryk for celleoverflademarkører – i dette eksempel M1 og M2 markører. Denne protokol kan udvides til andre undersøgelser, der kræver en gating standardmetode for at vurdere monocyt delmængde proportioner og monocyt delmængde udtryk for andre funktionelle markører.
Monocytter er en type af hvide blodlegemer, som spiller en stor rolle i at fremme og løse betændelse. Der er tre vigtigste delmængder af monocytter anerkendte, klassisk (~ 85%), mellemliggende (~ 5%) og ikke-klassisk (~ 10%) monocytter, som er karakteriseret ved deres niveau af klynge af differentiering (CD) 14 og CD16 udtryk1. Proportionerne af monocyt delmængder kan afvige med tilstedeværelsen af sygdom, såsom en øget andel af mellemprodukter i forskellige inflammatoriske stater2,3 , herunder hjerte-kar-sygdom, hvor niveauet for mellemprodukter er i forbindelse med kliniske begivenheder4,5. Derudover i sygdomstilstande, kan monocytter også gennemgå funktionelle ændringer, med mange ændringer kan påvises ved en forskel i overfladen markør udtryk6,7. Et sådant eksempel er monocyt M1-skævvridning, en stigning i datamærker forbundet med M1 makrofager, som er blevet observeret i hjerte-kar-sygdom, diabetes, fedme og metaboliske syndrom7,8,9 , 10.
Trods populariteten af flowcytometri at vurdere monocyt delmængde andel og funktion, er der en betydelig variation i forberedelse af prøver og delmængde gating mellem undersøgelser, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne mellem sådanne undersøgelser. Vigtigere, der er ingen konsensus i afgrænsningen af monocyt delmængder, endnu en standardiseret tilgang er væsentlige givet den kliniske betydning af ændringer i delmængde proportioner i flere sygdomme. En del af vanskeligheden ved gating skyldes, at monocytter differentiere fra den klassiske gennem mellemliggende til ikke-klassisk delmængde11 og som sådan, monocytter eksisterer som et kontinuert spektrum i stedet for adskilte populationer12 . Interessant, viste Zawada et al. , at ved hjælp af enten en rektangulær eller trapez gating af de mellemliggende delmængde, begge resulterede i en højere mellemliggende undersæt, der forudsagde en hjerte-kar-slutpunkt13. Dette understreger, at, mindst for beregning af proportioner, det centrale spørgsmål anvender en konsekvent gating strategi mellem forskellige prøver (og undersøgelser), frem for at forsøge endeligt diskriminerer mellem undersæt. Mens endelige gating kan være mere vigtigt, når man skal vurdere funktion, ændringen i markør udtryk mellem delmængder er trinvise12,14, og dermed igen, konsistens i gating er måske nøglen. Som sådan er er objektivt gating metode, reproducerbar fordele monocyt delmængder mellem forskellige prøver nødvendige. Formålet med metoden præsenteres her er at gate monocyt delmængder med en klar forklaring og begrundelse for den gating teknik ansat og vurdere delmængder for overflade markør udtryk, hvilket giver en metode, som gør det muligt for forskere at have tillid til brugen af denne teknik ved vurderingen af forskellige prøver.
Fuldblod flowcytometri er en ideel metode til at studere monocytter, som cellerne er undersøgt i forhold tæt på deres fysiologiske mikromiljø giver et indblik i deres roller i infektion og betændelsestilstande. Desuden brug af frisk (dvs. uforarbejdede) blodprøver minimerer ombygninger eller celle transformationer, der kan opstå på grund af oplagring eller håndtering af18,19, som dem, der vides at forekomme med fryse-optøet monocytter 20. hurtig prøveforberedelse anbefales som nogle markører er upregulated hvis prøverne opbevares ved stuetemperatur før behandling19. De optimale koncentrationer af M1 og M2 markører blev bestemt ved titrering, og dette skal gøres for enhver ny antistof at begrænse ikke-specifik binding, samtidig med at graden af Skift skyldes antigen udtryk og ikke begrænset af mangel på antistof. Fjernelse af røde blodlegemer og fiksering af hvide blodlegemer med lysis løsning er et vigtigt skridt i denne protokol, som tilstedeværelsen af røde blodlegemer kan interferere med flow flowcytometri21,22. Bemærk, at mens nogle lysis løsninger er forenelige med nej-vask farvning, klarere populationer er tydeligt i vores hænder når en vask trin bruges.
Korrekt opsætning af flow forskellige er også kritisk, når man sammenligner udtryk for monocyt markører. Vi anbefaler, at forskere opretholde konsekvent target fluorescens intensiteter af kontrol perler og udføre kvalitetskontrol på instrumentet, der bruges til at give ensartede resultater på tværs af forskellige prøver køre på forskellige dage. Ud over dette bruges isotype kontrolelementer til at bistå ved fortolkningen af enhver ikke-specifikke baggrund signal genereret af ikke-specifikke antistof bindende. Monocytter har høje niveauer af Fc-receptorer11 og derfor er tilbøjelige til ikke-specifik binding. Af note, ikke-specifik binding varierer for de forskellige delgrupper, og dermed brugen af en isotype kontrol bliver vigtigt når man sammenligner graden af markør udtryk mellem delmængder.
Et andet vigtigt kriterium skal betragtes som er gating trin ansat. Nogle undersøgelser tyder på, at det er afgørende for at tegne en stram gate omkring monocyt befolkning i FSC(A)/SSC(A) plot til at slippe af med de fleste af de ikke-monocytic CD16 positive celler23,24,25, men dette kan føre til tab af nogle monocytter ikke-monocyt celler kan overlappe hinanden med monocytter på FSC/SSC observationsområder26. I stedet for at udelukke enhver anden blodceller, der kan forurene monocytter, er medtagelsen af en tredje monocyt markør CD14 og CD16, væsentlige26,27. Af denne grund, HLA-DR bruges ofte og er ideel som det ikke udtrykkes af NK celler eller neutrofiler17,28. Selvom lymfocytter (B-celler og T-celler) kan give udtryk for HLA-DR, de adskiller sig fra monocytter i henseende til CD14 udtryk. Mens HLA-DR er en ideel tredje markør, CD86 er også blevet anbefalet5,27,29 , men var ikke brugt her da det er også en M1 markør og dermed dens udtryk på monocyt delmængder blev vurderet.
Validering af gating-strategien anvendes er af afgørende betydning. Mens NK-celler er kendt for at overlappe med ikke-sci.Fi, hvis de ikke er gated ud28, bemærker vi, at B-celler kan også overlappe med den ikke-sci.fi (figur 2B); om dette er tilfældet i andre undersøgelser kan afhænge af fluorokrom valg, instrument konfiguration, detektor følsomhed eller endda sygdom tilstand undersøges. Her, de overlappende B celler viste høj udtryk for HLA-DR og blev ikke lukket ud ved udvælgelse af HLA-DR positive celler i figur 1 d. Snarere, for at fjerne B celler brugte vi en ekstra plot af CD14 / HLA-DR, hvor B-celler udskille fra ikke-sci.Fi på grund af deres højere HLA-DR og lav CD14 udtryk.
Der er også mange forskellige måder, hvor portene til monocytter, selv er blevet trukket i litteratur; Disse omfatter kvadranter (delmængder er adskilt af kvadrant markører) og rektangulære eller trapez rubrik13 (med separate bokse trukket for hver delmængde), som desuden er forskellige i deres placering skildrer hvor en delmængde ender og en anden begynder. Disse sandsynlige forskelle afspejler det faktum at monocytter findes som et kontinuum af celler, differentiere fra klassisk til ikke-klassisk, ikke som klart adskilte populationer. Men fordi variationer i teknikker til at identificere delmængder, selv kan føre til forskelle i de beregnede monocyt delmængde proportioner, bliver det vigtigt, at metoden gating er rimeligt mål snarere end subjektivt, da dette vil gør metoden mere robust og reproducerbar. Nogle undersøgelser bruger en isotype kontrol for CD16 for at fastlægge grænsen mellem klassisk og mellemliggende delmængder30. På den anden side for at definere adskillelse mellem mellemprodukter og ikke-sci.Fi, er det blevet foreslået, at afgrænsningslinjen kan være lodret eller skrå, med valg op til efterforskerne, det forbehold, at det skal være reproducerbare, men en rektangulær gate er blevet anbefalet at lette sammenligninger mellem undersøgelser13,30,31. Her, blev øget objektiv opnået ved at plotte dataene på en zebra plot og anvende objektive visuelle regler, fordi zebra grunde give en yderligere visualisering cue ved at blande farveovergangen til hver lig sandsynlighed bin over en traditionel contour plot. Den højre kant af den klassiske delmængde blev udarbejdet sådan, at befolkningen var jævnt fordelt rundt befolkning median. Opdelingen mellem mellemprodukter og ikke-sci.fi var også standardiseret ved at have base for mellemprodukter justeres i forhold til bunden af de koncentriske cirkler inden for den klassiske befolkning (dvs. de mellemliggende befolkningen klart udtrykker høje niveauer af CD14, ifølge standard nomenklatur1).
Mens nogle undersøgelser har antydet brug af yderligere markører, såsom C-C chemokine receptor type 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) for at opnå succesfulde optælling af monocytter og til at afsløre deres kliniske betydning32,33 , i vores hænder af udtryk for mange monocyt funktionelle markører varierer meget mellem individer14. Denne variation kan begrænse nytten af disse markører til at definere delmængder baseret på deres udtryk. Automatiseret beregningsmæssige metoder har også været brugt til at visualisere og klynge monocyt delmængder herunder visuel interaktiv stokastiske nabo embedding (viSNE), t-distribueret stokastiske nabo embedding (tSNE) eller Spanning-tree Progression Analyse af normaliserede densitet begivenheder (SPADE)34,35, som kan give visuel repræsentation af de celler, der er baseret på sæt af flere markører, der anvendes. Mens dette har vist sig at øge nøjagtigheden af den gating strategi i monocyt delmængde klassificering, er det anerkendt, at en ulempe er antallet af antistoffer (og tilsvarende fluorophore kanaler) kræves. Dets anvendelighed vil afhænge af spørgsmål; den ekstra kompleksitet kan ikke være berettiget, for eksempel i optællingen undersøgelser.
Monocytter gated med vores teknik Vis proportioner i overensstemmelse med litteraturen og udtryk for celleoverflademarkører af de tre undersæt kan bestemmes let. Samlet, teknik og metode forklares her giver en standardiseret og ligetil metode til optælling monocyt delmængde proportioner og vurdere overflade markør udtryk, som kan udvides til at omfatte andre markører, så godt, hvilket validere deres funktionelle roller i forskellige andre forhold.
The authors have nothing to disclose.
Flowcytometri blev udført i Flow flowcytometri Core facilitet, der understøttes af Westmead Institut for medicinsk forskning, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales, og National sundhed og Medical Research Council. Denne undersøgelse blev støttet af klinisk kemi forskning og uddannelsesfond.
BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |