Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere monocytt delsett av fullblod flowcytometri. Dette inkluderer beskriver hvordan gate delsettene og vurdere deres uttrykk for overflate markører og gi et eksempel av evalueringen av uttrykket av M1 (inflammatoriske) og M2 markører (anti-inflammatorisk).
Monocytter er viktige bidragsytere i ulike inflammatoriske lidelser og endringer i disse cellene, inkludert delsett proporsjoner og funksjoner kan ha patologisk betydning. En ideell måte å undersøke endringer monocytter er fullblod flowcytometri minimal håndtering av prøver av denne metoden begrenser artifactual celle aktivering. Imidlertid tatt mange ulike tilnærminger til gate monocytt delsettene fører til strid identifikasjon av delsettene mellom studier. Her viser vi en metode som bruker fullblod flowcytometri å identifisere og karakterisere menneskelige monocytt delsett (klassisk, middels og ikke-klassiske). Vi skissere hvordan å forberede blodprøvene flowcytometri gate delsettene (sikre forurensende celler er fjernet) og bestemme monocytt delsett uttrykk for overflate markører, i denne eksempel M1 og M2 markører. Denne protokollen kan utvides til andre studier som krever en gating standardmetode for å vurdere monocytt delsett proporsjoner og monocytt delsett uttrykk for andre funksjonelle markører.
Monocytter er en type av hvite blodceller som spiller en viktig rolle i å fremme og løse betennelse. Det er tre viktigste delsett av monocytter anerkjente, klassisk (~ 85%), middels (~ 5%) og ikke-klassiske (~ 10%) monocytter, som kjennetegnes av graden av cluster for differensiering (CD) 14 og CD16 uttrykk1. Andelen monocytt delsett kan variere med tilstedeværelse som en økt andel av mellomprodukter i ulike inflammatoriske tilstander2,3 inkludert kardiovaskulær sykdom, hvor mellomprodukter er forbundet med klinisk hendelser4,5. Videre i sykdomstilstander, kan monocytter også gjennomgå funksjonelle endringer, med mange endringer detectable av en forskjell i overflaten markør uttrykk6,7. Et slikt eksempel er monocytt M1-forvrenger, en økning i markører knyttet M1 makrofager, som har blitt observert i hjerte-og karsykdommer, diabetes, fedme og Metabolsk syndrom7,8,9 , 10.
Til tross for populariteten til flowcytometri å vurdere monocytt delsett andel og funksjon, er det en betydelig variasjon i prøven forberedelse og delsett gating mellom studier som gjør det vanskelig å sammenligne resultatene mellom slike studier. Viktigst, det er ingen enighet i avgrensning av monocyte undergrupper, men en standardisert tilnærming er viktig gitt klinisk signifikans i endringer i delsett proporsjoner i flere sykdommer. Del på problemer gating oppstår fra det faktum at monocytter skille fra det klassiske gjennom mellomliggende til ikke-klassiske delsett11 og slik monocytter finnes som et kontinuerlig spekter i stedet for distinkte bestander12 . Interessant, viste Zawada et al. at ved hjelp av enten en rektangulære eller trapes gating av mellomliggende undergruppe, både resulterte i et høyere mellomliggende delsett som spådd en hjerte endepunktet13. Dette understreker at minst beregner proporsjoner, hovedsaken er søker en konsekvent gating strategi mellom ulike eksempler (og studier), heller enn å prøve å definitivt forskjellsbehandle delsett. Mens definitive gating kan være viktigere når vurdere funksjon, endringen i markør uttrykk mellom delsett er trinnvis12,14, og dermed igjen konsekvent gating er kanskje nøkkelen. Som sådan, er en målsetting gating metode som reproduserbar apportions monocytt delsettene mellom ulike eksempler nødvendig. Formålet med metoden som presenteres her er å gate monocytt delsett med en klar forklaring og begrunnelse for gating teknikken ansatt og vurdere delsettene for overflate markør uttrykk, noe som gir en metode som tillater forskere å ha tillit i bruk av denne teknikken når vurdere forskjellige prøver.
Fullblod flowcytometri er en ideell tilnærming til å studere monocytter som cellene er undersøkt i forhold nær sine fysiologiske microenvironment gir et innblikk i deres roller i infeksjon og inflammatoriske tilstander. Videre bruk av fersk (dvs. ikke behandlet) blodprøver minimerer endringer eller cellen transformasjoner som kan skyldes lagring eller håndtere18,19, som de oppstå med fryse-tint monocytter 20. rask eksempel forberedelse anbefales som noen markører er upregulated hvis prøver oppbevares ved romtemperatur før behandling19. De optimale konsentrasjonene av M1 og M2 merkene ble fastsatt av titrering, og dette bør gjøres for noen nye antistoff begrense uspesifisert bindingen samtidig som at graden av Skift av antigen uttrykk og ikke begrenset av mangel på antistoff. Fjerning av røde blodlegemer og fiksering av hvite blodlegemer lysis løsning er et viktig skritt i denne protokollen som tilstedeværelse av røde blodlegemer kan forstyrre flyten cytometri21,22. Merk at mens noen lyse løsninger er kompatibel med no-vask flekker, klarere populasjoner er tydelig i våre hender når en wash trinn.
Riktig oppsett av flyt-cytometer er også avgjørende når man sammenligner uttrykket av monocyte markører. Vi anbefaler at forskere opprettholde konsekvent målet fluorescens intensiteter av kontroll perler og utføre kvalitetskontroll på instrumentet brukes til å gi konsistente resultater på tvers av forskjellige prøver kjøre på ulike dager. I tillegg brukes isotype kontroller til å bistå i tolkningen av alle ikke-spesifikk bakgrunn signal generert av ikke-spesifikke antistoffer bindingen. Monocytter har høye nivåer av Fc reseptorer11 og derfor er utsatt for ikke-spesifikk bindende. Av notatet, nivået av ikke-spesifikk bindingen er forskjellig for ulike delsettene, og dermed bruk av en isotype kontroll blir viktig når du sammenligner graden av markør uttrykk mellom undergrupper.
Et annet viktig kriterium vurderes er gating trinnene ansatt. Noen studier antyder at det er avgjørende for å trekke en stram gate rundt monocytt befolkningen i FSC(A)/SSC(A) plot å kvitte seg med de fleste av de ikke-monocytic CD16 positive celler23,24,25, men dette kan føre til tap av noen monocytter som ikke-monocytt celler kan overlappe monocytter på FSC/SSC tomter26. Hvis du vil utelate noen andre blod celler som kan smitte av monocytter, er heller inkludering av en tredje monocytt markør i tillegg CD14 og CD16, essensielle26,27. Derfor HLA-DR brukes ofte og er ideelt som det ikke er uttrykt av NK celler eller nøytrofile17,28. Men lymfocytter (B-celler og T celler) kan uttrykke HLA-DR, avviker de fra monocytter i forhold til CD14 uttrykk. Mens HLA-DR er en ideell tredje, CD86 også anbefaler5,27,29 , men ikke som det er også en M1 markør og dermed graden av uttrykk på monocytt delsett ble vurdert.
Validering av gating strategien som brukes er av avgjørende betydning. Mens Celler NK er kjent for å overlappe med ikke-classicals hvis de ikke er gated ut28, ser vi at B-cellene også kan overlappe med den ikke-classicals (figur 2B); om dette er tilfelle i andre studier kan avhenge av fluorochrome valg, instrument konfigurasjon, detektor følsomhet eller selv sykdom tilstanden undersøkt. Her, overlappende B celler viste høy uttrykk for HLA-DR og var ikke gated ut av HLA-DR positiv celleutvalg i figur 1 d. Snarere for å fjerne B celler vi brukte en ekstra tomten av CD14 / HLA-DR, der B-cellene skille ut fra ikke-classicals på grunn av deres høyere HLA-DR og lav CD14 uttrykk.
Det er også mange forskjellige måter som portene for monocytter selv har blitt trukket i litteraturen; Disse inkluderer kvadranter (delsettene skilles med kvadrant markører) og rektangulære eller trapes13 (med separate bokser trukket for hver undergruppe) som videre varierer i plasseringen skildre der ett delsett slutter og en annen begynner. Disse forskjellene sannsynligvis gjenspeiler det faktum at monocytter finnes som et kontinuum av celler, skille fra klassisk til ikke-klassiske, ikke som tydelig atskilt populasjoner. Men fordi variasjoner i teknikker for å identifisere delsettene seg kan føre til forskjeller i beregnede monocytt delsett proporsjonene, blir det viktig at metoden gating er rimelig objektiv, i stedet for subjektive, da dette vil gjør metoden mer robust og reproduserbar. Noen studier bruker en isotype kontroll for CD16 for å finne grensen mellom klassisk og mellomliggende delsett30. På den annen side, hvis du vil angi avstanden mellom intermediates og ikke-classicals, har det blitt foreslått at cut-off linjen kan være vertikal eller skrå, med valg etterforskerne, forbehold om som det skal være reproduserbare, men en rektangulær gate har vært anbefalt å lette sammenligninger mellom studier13,30,31. Her, ble økt objektivitet oppnådd ved å plotte dataene på zebra tomten og bruke objektive visuelle regler, fordi sebra tomter gir en ekstra visualisering stikkordet ved å blande fargen gradient til hver lik sannsynlighet hylle over en tradisjonell kontur tomt. Høyre kant av klassisk delsettet ble trukket slik at befolkningen var jevnt fordelt rundt befolkningen medianen. Mellomprodukter og ikke-classicals ble også standardisert ved foten av intermediates justere med bunnen av de konsentriske sirklene i klassisk befolkningen (dvs. den mellomliggende befolkningen klart uttrykker høye nivåer av CD14, som standard nomenklatur1).
Mens noen studier har antydet bruk av ekstra markører, som C-C chemokine reseptor type 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) for å oppnå vellykket opplisting av monocytter og å avsløre deres klinisk betydning32,33 , i våre hender uttrykk for mange monocytt funksjonelle varierer mye mellom individer14. Slike variasjoner kan begrense nytten av disse markørene til å definere delsett basert på deres uttrykk. Automatisert computational tilnærminger har også blitt brukt til å visualisere og klynge monocytt delsett inkludert visuelle interaktive Stokastisk nabo innebygging (viSNE), t-distribuert Stokastisk nabo innebygging (tSNE) eller Spanning tree progresjon Analyse av tetthet-normalisert hendelser (SPADE)34,35, som kan gi visuell representasjon av cellene basert på settet til flere merker som brukes. Mens dette har vist seg å øke nøyaktigheten av gating strategien i monocytt delsett klassifisering, er det anerkjent som en ulempe er antall antistoffer (og tilsvarende fluorophore kanaler) kreves. Dens nytte avhenger på spørsmålene blir stilt; ekstra kompleksitet kan ikke være berettiget, for eksempel i opplisting studier.
Monocytter gated med våre teknikken viser proporsjoner i tråd med litteratur og uttrykk for overflate markører av tre delsettene kan bestemmes lett. Total, teknikk og metode forklart her gir en standardisert og grei metode for opplisting monocytt delsett proporsjoner og vurdere overflaten markør uttrykk som kan utvides med andre markører også, og dermed validere sin funksjonelle rolle i ulike andre forhold.
The authors have nothing to disclose.
Flowcytometri ble utført i Flow cytometri Core anlegget som støttes av Westmead Institutt for medisinsk forskning, Westmead forskning Hub, Cancer Institute New South Wales, og National Health and Medical Research Council. Denne studien ble støttet av klinisk kjemi forskning og utdanning fondet.
BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |