عزل الشرايين الشبكية للدراسات فيزيولوجيا الخلية السابقين فيفو
1Centre for Experimental Medicine,Queen’s University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education),Queen’s University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy,Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences,Queen’s University of Belfast
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا مباشرة لعزل الشرايين من شبكية الفئران التي يمكن استخدامها في الكهربية، الكالسيوم التصوير والضغط ميوجرافي الدراسات.
Abstract
شبكية العين هي أنسجة عالية أيضي نشطة التي تتطلب إمدادات كبيرة من دم. تداول الشبكية يعتمد الشبكية الداخلية، بينما سفن تشورويدال العرض فوتوريسيبتورس. التعديلات في نضح الشبكية تسهم في اضطرابات عديدة تهدد البصر، بما فيها اعتلال الشبكية السكري، فرع الشبكية والزرق انسداد الوريد. فهم الآليات الجزيئية التي تشارك في مراقبة تدفق الدم عن طريق الشبكية وكيف يتم تغيير هذه أثناء المرض العين يمكن أن يؤدي إلى تحديد أهداف جديدة لمعالجة هذه الأوضاع. الشرايين الشبكية السفن المقاومة الرئيسية للشبكية، ونتيجة لذلك، تلعب دوراً رئيسيا في تنظيم الهليوكبتر الشبكية من خلال التغييرات في القطر لومينال. في السنوات الأخيرة، قمنا بتطوير أساليب لعزل الشرايين من شبكية الفئران التي مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الدراسات فيزيولوجيا الخلية. هذا الإعداد قد بدأت تؤتي رؤى جديدة في كيفية تدفق الدم يتم التحكم في الشبكية وقد سمح لنا بالتعرف على بعض التغييرات الرئيسية التي تحدث أثناء مرض العين. في هذه المقالة، نحن تصف الأساليب لعزل الفئران الشرايين الشبكية وتشمل البروتوكولات لاستخدامها في التصحيح-المشبك الكهربية وتصوير الكالسيوم والدراسات ميوجرافي الضغط. هذه السفن أيضا قابلة للاستخدام في بكر-، الدراسات الغربية النشاف و immunohistochemistry على.
Introduction
فهم كيفية التحكم في تدفق الدم في الشبكية هدف هام، نظراً لتدفق الدم غير طبيعي كان متورطا في الآلية المرضية لمجموعة متنوعة من الأفق تهدد الأمراض الشبكية1،2،3، 4. وقد تداول الشبكية، التي تزود الخلايا العصبية الشبكية الداخلية والخلايا الدبقية، ترتيب نهاية شريان، مع كل من الدم من الشرايين الشبكية والشرايين التي يمر من خلال الشعيرات الدموية للاوردة الشبكية والاوردة5أخيرا. وينظم تدفق الدم في الشبكية بلهجة الشرايين الشبكية والشرايين، فضلا عن تقلص نشاط بيريسيتيس الموجودة على جدران الشعيرات الدموية الشبكية والاوردة الشعرية بعد6،7، 8-مراقبة لهجة الأوعية الدموية الشبكية معقد وهو عن طريق مجموعة من المدخلات من نظام الدورة الدموية ونسيج الشبكية المحيطة بها، بما في ذلك غازات الدم، وتعميم الجزيئات والهرمونات، والتضمين والإفراج عن المواد فعال في الأوعية من الشبكية والأوعية الدموية البطانة وماكروجليا9،،من1011. الشرايين الشبكية الفروع الشريانية الصغيرة للشبكية وهي تتألف من طبقة واحدة من خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية وبطانة داخلية مرتبة طوليا خلايا بطانية12،13، 14. هذه السفن تشكل الموقع الرئيسي لمقاومة الأوعية الدموية داخل الدورة الدموية الشبكية وذلك دوراً هاما في مراقبة تدفق الدم الشبكية المحلية. الشرايين الشبكية تنظيم تدفق الدم في الشعيرات الدموية في شبكية العين عن طريق معلقاً أو تقيد قطرها لومينال، توسط التغيرات في العضلات الملساء والأوعية الدموية كونتراكتيليتي10،15،16. فهم الآليات الجزيئية عن طريق الشبكية التي تنظم الشرايين نضح الشبكية ولذلك تتطلب استعدادات حيث يمكن الوصول إلى خلايا العضلات الملساء أرتيريولار ودرس في ظروف أقرب إلى الفسيولوجية قدر الإمكان.
السابقين فيفو الاستعدادات للأوعية الدموية الشبكية معزولة توفر الوصول إلى خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية، في حين لا يزال الإبقاء على وظيفة والتواصل مع البطانة الأساسية. ركزت معظم الدراسات حتى الآن باستخدام سفن منعزلة البقر أو الخنزير الشرياني سفن كبيرة (60-150 ميكرومتر). يمكن تحميل هذه الأسلاك متوفرة تجارياً أو أنظمة ميوجراف الضغط لتمكين الاستجواب الدوائي العضلات الملساء الوعائية خلية آليات الهوس17،18. هذه الاستعدادات قد أسهمت إسهاما كبيرا في معرفتنا بفيزيولوجيا الأوعية الدموية الشبكية في ظل الظروف العادية. واستخدمت دراسات قليلة الشرايين الشبكية المعزولة من الحيوانات المختبرية الصغيرة قطرها أصغر (~ 8-45 ميكرومتر) يمنع استخدامها في النظم التقليدية ميوجرافي19،20،،من2122. ميزة هامة، لاستخدام السفن من الحيوانات المختبرية الصغيرة غير توافر نماذج المرض المعدلة وراثيا والمعدلة وراثيا والشبكية على نطاق واسع. الحيوانات المختبرية الصغيرة أيضا أكثر قابلية للدراسات في فيفو التدخل.
هنا يمكننا وصف بروتوكولات واضحة لعزل وكانولاتينج الشرايين الشبكية الفئران للتجارب ميوجرافي الضغط. وترد أيضا Ca2 + تصوير الكهربية البروتوكولات واستخدام هذه السفن. وهذه تستطيع تقديم المزيد من رؤى في تنظيم contractility العضلات الملساء والأوعية الدموية وتدفق الدم في شبكية العين.
Protocol
جميع التجارب الموضحة هنا أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في قانون “المملكة المتحدة الحيوانات” (إجراءات علمية) لعام 1986 وأقرتها جامعة بلفاست الرفق بالحيوان للملكة وهيئة المراجعة الأخلاقية. 1-عزل الشرايين الشبكية ملاحظة: يتم استخدام البروتوكول التالي لعزل الشرايين الشبكية. هذا الأسلوب هو الأمثل للفئران الشرايين الشبكية ولكن يمكن استخدامها مع الماوس شبكية العين. ومع ذلك، عائد السفن، أقل عند استخدام الفئران. تشكل حلاً لانخفاض Ca2 + التي تحتوي على هانكس (لك) كما هو مبين في الجدول 1.ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل لمدة 3 أيام عند 4 درجة مئوية (عند استخدام تخزين لك، ضمان أن أنه اكويليبراتيس لدرجة حرارة الغرفة ودرجة الحموضة بشكل صحيح قبل الاستخدام). تجميع المعدات التالية قبل جمع الأنسجة لضمان ميكروديسيكشن السريع لشبكية العين: مسنن الملقط، مقص منحنى، تشريح طبق (صحن بيتري المغلفة بالسيليكون)، واحد ارتفع بليد، 2 مجموعات من الزجاج 1 (حادة) الملقط ماصة باستور (مصقول النار إلى تلميح السلس ولكن ليس ضيق)، 1 ماصة البلاستيك القابل للتصرف (مع تلميح قلص زيادة الفتحة إلى ~ 5-7 ملم)، الزجاج 1 الجولة قاع أنبوبة الاختبار (5 مل) وحامل. صب حوالي 50 مل لش في كوب زجاج وتحضير كوب ثانية صب سوائل النفايات.ملاحظة: انظر الجدول للمواد للمواصفات والتفاصيل من الشركة المصنعة. Euthanize الفئران باستخدام CO2 متبوعاً بثقب القلب إلى اكسسانجويناتي (تجنب التفكك عنق الرحم أو ارتجاج في الدماغ كهذه قد تتلف الأوعية الدموية في العين). سحب الجفون مع ملقط مسنن، ثم استخدام مقص المنحنى لقص حول العضلات المداري، وعن طريق العصب البصري. استخراج العينين بلطف من المدار مع الحرص على قطع طريق أي مرفقات المتبقية مع مقص. مكان العيون مغمورة في حل لك على طبق تشريح (العيون ويمكن نقلها على الجليد في حل لك إذا لزم الأمر). استخدام مجموعة واحدة من الملقط حادة إلى ارتساء العين للطبق بالضغط على المرفقات العضلات المدارية أو العصب البصري؛ ضمان أن ترسيخ النقطة أقرب ما يكون إلى الصلبة لتحقيق الاستقرار في العين. استخدام الشفرة، قطع طريق القرنية على طول ora serrata وإزالة العدسة بالضغط بلطف على الصلبة العينية بالملقط. تقطع بكأس العين في نصف شكل متناظر من خلال القرص البصري. استخدام مغلقة الملقط بلطف ‘فرشاة’ خارجاً شبكية العين من نصفي فنجان العين مع الحرص على إزالة أي مرفقات المتبقية في القرص البصري. كرر هذه العملية مع العين الثانية ونقل شبكية العين تشريح في أنابيب الاختبار استخدام ماصة بلاستيك وصغيرة قطره من المتوسطة لك. استخدام الماصة البلاستيكية وملء أنبوبة الاختبار مع لك إلى ~ 5 مل والسماح لشبكية العين لتسوية للأسفل. تغسل الأنسجة حوالي 3 مرات عن طريق إزالة ~ 4 مل من محلول من الأنبوب وإضافة جديدة لك استخدام ماصة بلاستيكية. حيثما كان ذلك ضروريا، قم بإزالة أنسجة دخيلة مثل الأربطة سوسبينسوري والزجاجي والشعر. يغسل داخل الزجاج ماصة باستور (نصيحة المصقول) مع لش للحيلولة دون التمسك الماصة الأنسجة. استخدام ماصة نفسه، إزالة ما يقرب من 4 مل من محلول من أنابيب الاختبار. ثم أضف حوالي 2 مل من جديد لك. ننأى بلطف (تريتوراتي) شبكية العين عن طريق رسم الأنسجة عن طريق غيض الزجاج “الماصة؛” ببطء وطرد المحتويات إلى أنابيب الاختبار. ملاحظة، وليس محاولة لإدخال فقاعات في هذه المرحلة. كرر الخطوة 1، 10 حتى انقسموا شبكية العين إلى حجم ما يقرب من 2-3 مم2. يغسل داخل الماصة مع حوالي 2 مل لك وطرد هذا إلى أنابيب الاختبار. تسمح المحتويات تسوية لأسفل أكثر من 5-10 دقيقة. كرر عملية تريتوريشن كما هو مبين في 1.10-1.12 مع قوة أكثر قليلاً حتى يتم قطع الأنسجة حوالي 1 مم2 في الحجم. ومرة أخرى، تسمح الأنسجة تسوية لمدة 5-10 دقائق. كرر الخطوات من 1، 1، 10-12 مرة ثالثة مع المزيد من القوة حتى تجانس المحتويات الكامل ولا تزال أي قطع من الشبكية (الحل ينبغي أن تصبح حليبي في المظهر).ملاحظة: سيؤدي هذا الأسلوب تصل إلى 8 شرائح أرتيريولاري (خالية نسبيا من المحيطة نيوروبيلي، ومع بعض الفروع المتبقية سليمة) في معزل عن قياس 8-45 ميكرومتر في القطر و 200-2500 ميكرومتر في الطول. نقل كمية صغيرة من عزل في غرفة تسجيل فسيولوجية أو إضافة الأصباغ الفلورية لقياس Ca2 + تركيز داخل الخلايا ([Ca2 +]i) (انظر القسم 3). التخلص من مخلفات الكؤوس العين والحل إزالة أثناء عملية العزل وفقا للقواعد المحلية في التعامل مع النفايات الحيوانية.ملاحظة: في حين أنه من الأفضل لهذه التجربة على السفن فورا بعد عزلة، يمكن تخزين عزل الفائض عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات. 2-أرتيريولار ضغط ميوجرافي ملاحظة: يتم ضغط أرتيريولار ميوجرافي كما يلي باستخدام المعدات بالتفصيل في الشكل 1 ألفو ب و الجدول للمواد. نقل قاسمة هوموجيناتي سفينة الشبكية (مل 1-2؛ المعزولة وفقا للفرع 1) إلى دائرة تسجيل فسيولوجية (جزئيا مليئة اسمياً الحل Ca2 +مجاناً هانكس؛ 0Ca2 + هانكس؛ انظر الجدول 1) شنت على المرحلة المجهر المقلوب. مغادرة السفن إلى تسوية على الجزء السفلي من الدائرة تسجيل لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التجريب. مسح بصريا عبر غرفة تسجيل لتحديد الشرايين > 200 ميكرومتر في الطول وتمتلك نهاية مفتوحة يمكن من خلالها مقني السفينة (تحديد نوع السفينة هو استكشاف المزيد في قسم النتائج). موقف السفينة في المركز مجال الرؤية. في حالة وجود لا سفن مناسبة نقل قاسمة آخر من السفينة هوموجيناتي في قاعة التسجيل حسب الخطوة 2.1. مرساة واحدة من نهاية السفينة باستخدام الملقط غرامة وزلة سلك تنغستن صغيرة (75 ميكرون القطر و ~ 2-4 مم في الطول) الموضوعة على السفينة (انظر الشكل 1(ط)). للقيام بذلك عقد السلك في الملقط وموقع الملقط أعلاه دائرة التسجيل. تحديد الظل المطابق الملقط تحت المجهر، أقل الملقط في الحمام حتى تتضح الأسلاك. ضع الأسلاك ميكرومتر سفينة ما يقرب من 200 من النهاية المفتوحة وإسقاط السلك عمودي على المحور الطويل للسفينة.ملاحظة: وزن سلك التنغستن يكفي أوككلودي السفينة ديستالي وقف تدفق المحتويات لومينال أثناء كانوليشن والضغط. نقل أرتيريولي في موضع مناسب داخل قاعة تسجيل مثل أن تقع أفقياً عبر الحمام مع نهاية مفتوحة تمشيا مع قنية ذات (انظر الشكل 1(ثانيا-رابعا)). القيام بذلك بإيعاز بلطف بكشف سلك التنغستن أوككلودينج مع مقطع إضافي من الأسلاك التي عقدت داخل الملقط؛ لا تلمس أرتيريولي كما أنها سوف تلتزم بدون رجعة الملقط. حيثما كان ذلك ضروريا (لشرائح طويلة arteriole)، إضافة كشوف سلك التنغستن إضافية على السفينة أن المسافة بين نهايات المغطى وفتح السفينة هو لا يزيد عن 200 ميكرومتر؛ وهذا يساعد على منع arteriole الانتقال خارج مجال الرؤية عند الضغط. إذا كان للسفينة أي الفروع الجانبية، وهذه ينبغي أن تغطي أيضا مع كشوف سلك التنغستن إضافية. إذا كان لا يمكن أن تغطي فرع جانب تجاهل السفينة. نتخلل الدائرة مع 0Ca2 + هانكس في 37 درجة مئوية لإزالة نسيج الشبكية دخيلة والحارة حمام لدرجات حرارة الفسيولوجية.ملاحظة: يمكن استخدام نظام سخان التروية وفي خط حمام الجاذبية قياسية لهذا الغرض (انظر الشكل 1A). 0Ca2 + هانكس يستخدم لتسهيل إجراءات كانولاتيون، منذ إزالة مرجع مصدق خارجي2 + يضمن أن تظل الشرايين المتوسعة. اختﻻق cannulas الضغط من الشعيرات الدموية فيلامينتيد البورسليكات الزجاج (تلميح قطر ~ 3-10 ميكرون حسب قطر السفينة إلى أن مقني؛ وسفن أصغر حجماً تتطلب cannulas أضيق؛ انظر الجدول للمواد) باستخدام ساحبة ميكروليكترودي وتعبئة الخلفية مع الحل 0Ca2 + هانكس. ضمان هو مدبب عرقوب القنية بلطف نحو تلميح لتسهيل كانوليشن. جبل القنية في حامل ماصة المرفقة بحقنه 10 مل عبر موصل Y وحنفية 3-الطريق؛ يتم استخدام هذا للضغط على النظام، وضغط يجري تسجيلها باستخدام لكنها إرفاقه الجانب-الذراع الأخرى للموصل Y (انظر الشكل 1B).ملاحظة: مطلوب ماصة ‘مساعد’ المساعدة في عملية كانوليشن. اختﻻق الماصة من زجاج البورسليكات شعرية سحبت على ساحبة ميكروليكترودي لنصيحة قطرها من 0.5-2 ميكرومتر. بشدة إطلاق النار البولندية الماصة (غالباً حتى إغلاق) باستخدام ميكروفورجي. عناية ضع ماصة مساعد بزاوية على المحور الطويل للسفينة قريبة من نهاية مفتوحة باستخدام مناور ميكانيكية 3-محور (انظر الشكل 1). ضع ماصة مساعد فقط فوق السفينة، ولكن عدم لمس ذلك. ضع ماصة كانوليشن في النهاية المفتوحة للسفينة (انظر الشكل 1 و 2 (أ)(i)) باستخدام ميكرومانيبولاتور ما يرام؛ ضع طرف متاخم لفتح، حسب تقييم ضبط الطائرة من التركيز على المجهر (في 20 X). عند كل نهاية من السفينة ونصيحة قنية في التركيز في نفس الوقت بشكل صحيح يتم وضع القنية كانوليشن (انظر الشكل 2 (أ)(ii)). النهوض قنية ذات الفتحة السفينة باستخدام عناصر التحكم المحور السيني من ميكرومانيبولاتور الجميلة (انظر الشكل 2 ألف(ثالثا)). تقييم نجاح كانوليشن عن طريق تحريك قنية على طول المحور الصادي. إذا كان لا يزال القنية داخل السفينة مقني بنجاح (انظر الشكل 2 (أ)(رابعا)). إذا تحرك القنية خارج السفينة، القنية من المرجح أن تكون فوق السفينة؛ إذا كان الأمر كذلك كرر الخطوة 2.10-2.11 مع قنية على طائرة أقل في محور ع. عند نجاح كانوليشن بلطف أقل ماصة مساعد على ظهر السفينة لكبح جماح في أرتيريولي. دليل الجدار أرتيريولار عبر قنية الضغط مع ماصة مساعد، في نفس الوقت كما هو متقدم ماصة كانوليشن زيادة في التجويف السفينة إلى مسافة حوالي 30-50 ميكرون (انظر الشكل 2 أ(الخامس والسادس)).ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء المتزامنة، التي تسيطر عليها حركة كل المتلاعبين (مساعد ماصة تتحرك نحو القنية بينما يتحرك القنية في التجويف السفينة)، وسوف تتطلب ممارسة واسعة النطاق لتحقيق نسبة نجاح عالية. تغيير الحل حمام إلى هانكس العادي الذي يحتوي على 2 مم Ca2 + (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية. عادة ما يؤدي هذا إلى تضييق طفيف أرتيريولي وتشكيل ختم ضيق حول قنية ذات. يمكن ثم نقل ماصة مساعد بعيداً عن السفينة. السماح بختم ضيق وضع 15 دقيقة عرض السفينة باستخدام كاميرا USB (وصورة اقتناء البرمجيات) يعلق على المجهر، وضبط التركيز تحقيق أقصى قدر من التناقض بين حدود السفينة والمساحات الخارجية وإينترالومينال (انظر الشكل 2B). صورة السفينة في 0.5-5 إطارات/ثانية. بعد 1 دقيقة من التسجيل في 0 ملم زئبق، زيادة الضغط إينترالومينال إلى المستوى المطلوب عن طريق إغلاق الحنفية 3-طريقة تعلق على قنية ذات (انظر الشكل 1B) وتنطبق على كمية صغيرة من الضغط الإيجابي للنظام عن طريق المحاقن. مراقبة الضغط تغيير المعني لكنها.ملاحظة: الضغط يمكن إضافة طريقة خطوة حكيمة ما يصل إلى 100 ملم زئبقي أو إلى قيمة واحدة على سبيل المثال 40 مم زئبق (تقارب الضغط أرتيريولار الشبكية في فيفو)23. وينبغي أن تمدد السفينة سرعة يؤكد نجاح كانوليشن. يرجى ملاحظة، والضغط الناجم عن تضيق الأوعية (أي، رد شذوذ) ستضع في وقت لاحق خلال فترة 15 دقيقة، ولكن بسبب الحجم الصغير لهذه السفن، وهذا قد لا يكون دائماً يمكن كشفها بصريا. مراقبة السفينة خلال ذات الأولية لتسرب واضحة. قد تنشأ مصادر تسرب من الفروع الجانبية ملصوق أو عدم كفاية ختم القنية إلى داخل أرتيريولي. لمشاهدة محتويات intraluminal مغادرة السفينة. قد اتضح الثقوب أصغر حجماً وأقل وضوحاً مع مرور الوقت كانخفاض في الضغط على لكنها. إذا كان ذلك ممكناً، أوككلودي فتح مع كشوف سلك التنغستن إضافية مع الحرص على عدم تعكير القنية. استبعاد الأعمال التحضيرية مع تسرب واضحة من مزيد من التحليل. تطبيق الدواء أبلومينالي الاهتمام إلى السفينة قبل أو التالية، ذات 15 دقيقة اعتماداً على الأهداف التجربة (السابق يسمح تأثيرات على التنمية للهجة شذوذ تحدد فيما بعد، في حين تمكن الأخير تحليل للآثار في حالة مستقرة شذوذ لهجة). صورة نظام إيصال المخدرات نموذجية في الشكل 3 ألف. ضع مأخذ توصيل عمودي إلى جزء السفينة للفائدة (كما هو موضح في الشكل 1) على مسافة ~ 500 ميكرومتر بعيداً عن سفينة الاهتمام مع الحرص على ضمان أن المآخذ على النحو الأمثل الزاوية بالكامل سوبيرفوسي المنطقة (انظر الشكل 3B). التأكد من أن التغييرات في التروية لا تخل فعلياً السفينة. بعد انتهاء تجربة، تطبيق حل 0Ca2 + هانكس التي تحتوي على 10 ميكرون وورتمانين (الميوسين سلسلة الخفيفة kinase مثبط) أقصى درجة تمدد السفينة لتحديد القطر السلبي.ملاحظة: يمكن اختبار قوة ختم cannulation في ختام هذه التجربة برفع الضغط intraluminal > 100 ملم زئبق. وستظل غالبية السفن المرفقة حتى في هذا الضغط العالي التي تشير إلى ختم ضيق. إجراء التحليل دون اتصال باستخدام الكشف عن الحافة لتعقب التغييرات في قطر أرتيريولار (انظر الجدول للمواد للبرنامج المقترح). تطبيع قطر arteriole إلى القطر السلبي للمقارنة بين السفن. 3-Ca2 + تصوير ملاحظة: تعد معزولة الشرايين الشبكية للتقليدية (ميكروفلوريميتري) و [كنفوكل] Ca2 + التصوير كما يلي (باستخدام المعدات بالتفصيل في الجدول للمواد). إعداد هوموجيناتيس الشبكية في أنبوب اختبار زجاج 5 مل كما هو موضح في المقطع 1. إضافة إلى 1 مل هوموجيناتي الشبكية Fura-02:00 ص (ميكروفلورميتريك Ca2 + تسجيل) أو فلوو-04:00 ص ([كنفوكل] Ca2 + تصوير) لإعطاء تركيز نهائي من 5 ميكرومتر (حماية من الضوء)؛ تحميل المؤشرات صبغ تفضيلي في خلايا العضلات الملساء. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 2 التحريك إلى جانب الأنبوب كل 15-20 دقيقة إعادة تعليق نسيج الشبكية. وبعد ذلك، يضعف هوموجيناتي 1:4 مع حل لك للحد من زيادة صبغ تحميل.ملاحظة: السفن تبقى قابلة للحياة لما يصل إلى 6 س (عند تخزينها على 4 درجة مئوية وفي الظلام)؛ ولكن من المستحسن أن تبدأ التجارب أقرب الحد من تأثير تقسيم الصبغة في العضيات الداخلية أو قذف من الصبغة على مر الزمن. نقل 1-2 مل هوموجيناتي الشبكية إلى حجرة زجاجية تسجيل (جزئيا مليئة لك) التي شنت على مرحلة المجهر المقلوب متصل إلى Ca2 + ميكروفلوريميتري أو نظام الفحص المجهري [كنفوكل]. ربط الشرايين عمودي على اتجاه التدفق عبر دائرة التسجيل، مع كشوف سلك التنغستن (50 ميكرومتر في القطر، 2-4 مم في الطول) متباعدة ~ 100-200 ميكرومتر وبصرف النظر على طول السفينة (انظر الشكل 3) باستخدام تقنية مشابهة للتي وصفها في الخطوة 2، 3. نتخلل الحمام مع الحل الطبيعي Ca2 + هانكس عند 37 درجة مئوية. ضع مأخذ توصيل المخدرات كما في الصورة في الشكل 3 وعلى المخدرات كما هو موضح في الخطوة 2.17 من السفن. ل Ca2 + التصوير التقليدي، إلقاء الضوء على السفينة مع 340/380 نانومتر الضوء عبر هدفا غمر الأشعة فوق البنفسجية النفطية (مثلاً 100 X، 1.3 غ) وجمع الأسفار المنبعثة في 510 شمال البحر الأبيض المتوسط عبر فوتون عد أنبوب ضوئي (PMT). في نهاية كل تجربة، قياس الخلفية الفلورية بتبريد السفينة مع حل الذي يحتوي على الحركة (انظر الجدول 1). استخدام نسب تصحيح الخلفية الفلورية (R-F340/F380) لتحليل أو تحويل إلىداخل الخلية Ca 2 + ([Ca2 +]i) باستخدام صدقيقة وقياساتماكس R (انظر الجدول 1؛ قبل تطبيقها لتبريد 24) و المعادلة جرينكيفيتش25. [كنفوكل] Ca2 + التصوير، تثير فلوو-4 تحميل السفن في 488 نانومتر والتقاط الانبعاثات الناتجة من الأسفار في 490-535 نانومتر أما خط مسح الوضع (xt) أو زيت المسح الضوئي وسائط (512 × 512 بكسل؛ واقترح الثقب 300 نانومتر). تطبيع القياسات للأسفار سجلت عند الزمن t = 0s (F/و0). تقييم أي تغيرات في [Ca2 +[i خلال التطبيقات المخدرات أو الضغط دون اتصال في مناطق محددة من الفائدة (رويس) استخدام برنامج تحليل الصور. إذا لزم الأمر، إجراء Ca2 + التصوير مع الضغط ميوجرافي.ملاحظة: لقد تم تحسين الأوصاف المذكورة أعلاه للسفن أونبريسوريزيد؛ ومع ذلك من الممكن الجمع بين Ca2 + التصوير مع الضغط ميوجرافي كما يلي. عزل الشرايين وفقا للمادة 1. تحميل مع Ca2 + مؤشر الأصباغ وفقا للخطوة 3.1-3.2. نقل في الشرايين إلى دائرة التسجيل وكانولاتي وفقا للمادة 2. الحرص على الحد من التعرض للضوء أثناء إجراء التركيب. قياس Ca2 + حسب الخطوة 3.5 أو 3.7 أعلاه. ممارسة الضغط على السفينة وكرر القياس من Ca2 +. قياس واحد من قطر السفينة فيعتمد على طريقة Ca2 + القياس والمعدات المستخدمة.ملاحظة: [كنفوكل] Ca2 + القياس قد تكون ضرورية لصورة مناطق منفصلة ذات ما قبل وما بعد نتيجة تبيض من الصبغة أثناء التعرض لفترة طويلة الضوء. 4-التصحيح-المشبك الكهربية ملاحظة: يتوفر تسجيل كامل الخلية وقناة واحدة من خلايا العضلات الملساء أرتيريولار الفردية لا تزال مضمنة داخل تلك الشرايين الأصل على النحو التالي (باستخدام المعدات بالتفصيل في الجدول للمواد). عزل والارتساء الشرايين الشبكية في قاعة التسجيل كما هو موضح في الخطوات 1، 2، 3، و 3-3. لتسجيل التصحيح-المشبك، متباعدة سلك التنغستن كشوف 200 800 ميكرومتر وبصرف النظر على طول السفينة. إزالة الصفيحة القاعدية المحيطة أرتيريولي وكهربائيا فصل خلايا العضلات الملساء المتاخمة وخلايا بطانية الأساسية قبل لقط التصحيح. للقيام بذلك، سوبيرفوسي السفينة بسلسلة متتابعة من حلول إنزيم (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية للمدة المطلوبة.ملاحظة: مدة التعرض الإنزيم هو الأمثل للفئران الشرايين الشبكية (البروتياز، ~ 8 دقيقة؛ كولاجيناز، ~ 12 دقيقة) ويعتمد على معدل تدفق نظام إيصال المخدرات (~ 1 مل/دقيقة في الإعداد لدينا) وأنشطة وحدة دفعة من الإنزيمات المستخدمة. تقييم مستوى الهضم على فصل مرئي من بطانية وطبقات العضلات الملساء أثناء كولاجيناز خطوة كما هو موضح في الشكل 4. بمجرد فصل الطبقات خلية يلاحظ (كما هو موضح في الشكل 4B)، تطبق الدناز أنا الحل (~ 4 دقيقة) ثم إنهاء عملية الهضم بالاستعاضة عن حل حمام مع الحل الطبيعي Ca2 + هانكس. إزالة أي خيوط المتبقية من الصفيحة القاعدية و/أو نيوروبيلي الطرفية التي تجتاح نصائح مغلقة من الملقط غرامة على طول سطح السفينة بعناية. سحب والبولندية الزجاج الشعيرات الدموية (جدول المواد)، التعبئة مع الحل ماصة (الجدول 1) ومكان أمن في حامل ماصة هيدستاجي التصحيح-المشبك. موقف الماصة بزاوية 45 درجة بالنسبة لدائرة التسجيل ودفع نحو السفينة باستخدام الإعداد الخشنة في ميكرومانيبولاتور يجهز. حدد خلية العضلات الملساء بارزة من الجدار السفينة والسطح الذي يخلو من الحطام مرئية (انظر الشكل 4 باء). ضع غيض ماصة التصحيح عمودياً فوق الخلية للفائدة وانخفاض تدريجيا باستخدام حركة بطيئة/الغرامة ميكرومانيبولاتور لجعل الاتصال مع غشاء العضلات الملساء. تقييم الاتصال بين الخلية وماصة بصريا من حركة الخلايا وتغيير في المقاومة ماصة تقاس باستخدام بروتوكول اختبار الغشاء (الختم) في اقتناء البرمجيات (5-10 mV خطوة سلبية من 0 mV، تردد 25 كيلوهرتز؛ انظر الشكل 5A(ط)) . عندما زاد إضعاف المقاومة الختم (مثلاً، ارتفع من 2 إلى 10 MΩ؛ الشكل 5A (ثانيا)) تطبيق الضغط السلبي عابر إلى الجزء الخلفي صاحب ماصة عبر موصل y، الحنفية 3-طريقة، والمحاقن وأنابيب تعلق على حامل ماصة (تجميعها بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة في الضغط الشرايين، انظر الشكل 1B). تكرار تطبيقات ضغط السلبي حتى جيجاسيل (> 1 GΩ المقاومة؛ كما يتبين من اختبار الغشاء في اقتناء البرمجيات) هو تشكيل (الشكل 5 ألف(ثالثا)). ملاحظة قد تستغرق هذه العملية دقيقة 1-5. إذا فشل جيجاسيل للنموذج، اختر خلية مختلفة المشبك التصحيح باستخدام ماصة تصحيح طازجة. تطبق عقد محتملة للخلية عن طريق اقتناء البرمجيات حسب التجربة المنجزة (أم عادة 0-40 أو-80). دراسة نشاط قناة واحدة (في الخلية) في التشكيل الحالي. وبدلاً من ذلك، إنشاء بقع من الداخل إلى الخارج بسرعة تراجعه ماصة التصحيح من سطح الخلية بعد تشكيل جيجاسيل. كما يمكن إعادة يصلب ينتهي مجاناً من الغشاء تحت هذه الظروف إزالة الماصة من الحمام عن طريق السريع الحركة الرأسية المناول (الخشنة الإعداد). سرعة العودة عن طريق جراحة لإزالة الغشاء بعد إصلاحه تاركة فقط التصحيح داخل الحافة ماصة. ضبط تردد أخذ العينات على اقتناء البرمجيات إلى 5 كيلو هرتز وتنشيط وضع تسجيل متواصل للقناة سجل النشاط. تطبيق أية تغييرات الفولتية إذا لزم الأمر عن طريق البرنامج أو مكبر للصوت. إذا لزم الأمر، تطبيق المخدرات للتصحيح السفينة/الغشاء كما هو موضح في الخطوة 2.17. إذا تمدد غشاء مطلوب، تطبيق الضغط السلبي على الخلفي ماصة استخدام المحاقن يعلق على لكنها عبر موصل y و 3-طريقة الاستفادة. تحليل تسجيلات قناة وحيدة للاحتمالات مفتوحة والموصليه الوحدوي وفقا للإجراءات الموحدة26. لكامل الخلية الحالية تسجيل الماصات السحب والبولندية وفقا الجدول للمواد، ملء مع الحل ماصة تحتوي على الامفوتريسين ب (إضافة 3 مغ من الامفوتريسين ب 50 ميليلتر من [دمس]؛ إضافة ميليلتر 3-6 من هذا إلى 1 مل من محلول كامل الخلية الماصة؛ sonicate إلى مزيج) وشكل ختم وفقا للخطوات 4.6 4.9. بسبب إدراج الامفوتريسين بليس هناك حاجة تمزق الغشاء داخل طرف الماصة على الوصول إلى كل خلية. مراقبة الوصول، والتي سوف تكون اكتسبت تدريجيا، استخدام بروتوكول اختبار الغشاء في اقتناء البرمجيات (-20 mV خطوة من-40 mV، تردد العينة 25 كيلوهرتز؛ انظر الشكل 5 (ب)). تركيب الآلي للعابرين بالسعة في بعض البرامج غلة القياسات في الوقت الحقيقي للوصول إلى المقاومة والسعة خلية (بدلاً من ذلك يمكن تقييم الانخفاض النسبي للعابرين واسطة العين). حالما يسقط المقاومة الوصول إلى < 15 MΩ، تنفيذ سلسلة المقاومة تعويضات (الشكل 5) باستخدام الأوجه المعلمة كامل الخلية (السعة وسلسلة المقاومة) على مكبر للصوت. للقيام بذلك، استخدام القيم الآلي المناسب لتعيين الأوجه (انظر الشكل 5(ثانيا)) في البداية ثم زيادة طلب التعويض المقاومة سلسلة (التنبؤ وتصحيح إذا كان متوفراً على مكبر للصوت) إعادة ضبط التعويضات خلية كاملة بينما الحد عابرة بالسعة (انظر الشكل 5(ثالثا)). مع الحرص على عدم تعويض أكثر (كما هو موضح في الشكل 5(رابعا)). عادة، فمن الممكن أن تعوض المقاومة سلسلة بنسبة 75% في وضع التصحيح مثقبة (يتطلب تعويض الفارق تعيين الحد الأقصى). في حالة توفر لا تركيب الآلي، ابدأ بإعداد المعلمات كامل الخلية يطلبه للجبهة الوطنية 15 و 15 mΩ (القيم النموذجية لهذه الخلايا)، ثم قم بضبط لإنتاج النواتج كما هو موضح في الشكل 5(ثانيا). طلب زيادة التعويض المقاومة سلسلة الاتصال الهاتفي ~ 75 في المائة وتعديل المعلمات كامل الخلية وفقا الرقم 5(ثالثا). قبل البدء في التجريب ملاحظة قياس السعة الخلية من تركيب الآلي الأولية أو من الاتصال الهاتفي بعد تعويض اليدوي.ملاحظة: يتم استخدام هذه القيمة لتطبيع التيارات لحجم الخلية. التعويض عن سلسلة المقاومة قد تحتاج إلى تعديل خلال التجريب كما قد يستمر الوصول لتحسين نتيجة لزيادة إدماج الامفوتريسين بفي التصحيح. تطبيق المخدرات على السفن كما هو موضح في الخطوة 2.17. تطبيق بروتوكولات الجهد (خطوات أو سلالم) وفقا لمتطلبات التجريبية.ملاحظة: الجهد نموذجي خطوة البروتوكولات، 0.1-1 يتم تطبيق s في المدة من عقد بزيادة إمكانات في المتوسط 10-20 كل 5-10 ق لإنتاج عائلة من التيارات تنشيط الجهد. بدلاً من ذلك استخدام البروتوكولات المنحدر لقياس التيارات في سلسلة من الفولتية في أحد ‘الاجتياح’ بتكثف الجهد ببطء (100-200 أم/s) من مثل -80 إلى + 80 mV (تطبيق كل s 5-10) مع أخذ العينات دون اتصال الحالي على 10 mV فترات خلال المنحدر. من الممكن الجمع بين Ca2 + تصوير مع التصحيح-المشبك التسجيل كما يلي. عزل الشرايين وفقا للمادة 1. تحميل مع Ca2 + مؤشر الأصباغ وفقا للخطوات 3.1-3.2. جبل في قاعة التسجيل وفقا للمادة 4. الحرص على الحد من التعرض للضوء أثناء هذه الإجراءات.ملاحظة: حتى الآن فإنه لم يتسن للجمع بين المشبك التصحيح مع الضغط الدراسات ميوجرافي بسبب فقدان الغشاء وسلامة السفينة أثناء عملية الانفصال الانزيمية
Representative Results
ويبين الشكل 6A تخطيطي رسم شجرة الأوعية الدموية الشبكية الفئران. يتراوح قطرها (30-45 ميكرومتر) من الدرجة الأولى والدرجة الثانية (20-30 ميكرومتر)، والشرايين الشعرية مسبقاً (8-20 ميكرومتر) وأكدت تجريبيا في المختبر بتصوير [كنفوكل] من الفئران الشبكية جبل كل الاستعدادات إيمونوهيستوتشيميكالي المسمى للعضلات الملساء α أكتين (الشكل 6B). عند الانفصال الشبكية، يمكن تحديد الشرايين الشعرية ما قبل الابتدائي والثانوي على أساس العيار وترتيب خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية. تظهر بصريا مماثلة تحت الفحص المجهري مشرق الميدان الشرايين الترتيب الأول والثاني، ولكن يمكن تمييزها على أساس حجمها (الشكل 6). هي أصغر الأوعية الشريانية في الإعداد الشرايين الشعرية مسبقاً ويمكن التعرف عليها بسهولة بسبب بهم لكن ترتيب ألياف العضلات الملساء والأوعية الدموية. ويمكن تمييزه بوضوح الشرايين معزولة من الشعيرات الدموية والاوردة داخل العزلة. الشعيرات الدموية تتضح meshwork سفن صغيرة العيار (4-10 ميكرومتر في القطر)، بينما تكون الأوردة رقيقة الجدران وتفتقر إلى تغطية الخلية العضلات الملساء (الشكل 6). الشرايين الشعرية ما قبل الابتدائي والثانوي مناسبة لضغط ميوجرافي، Ca2 + تصوير والتصحيح-المشبك الدراسات. يبين الشكل 7 تجربة ميوجرافي ضغط حيث قد تم مقني الفئران الابتدائي arteriole شبكية وضغط intraluminal يرتفع إلى 40 ملم زئبق. ثم يبقى أرتيريولي في هذا الضغط للسماح لتطوير شذوذ لهجة قبل إضافة 0Ca2 + هانكس التي تحتوي على 10 ميكرون وورتمانين للحصول على القطر السلبي من السفينة. يبين الشكل 7 ألف photomicrographs أرتيريولي في نقاط زمنية مختلفة أثناء التجربة. قد تم رسم سجل كامل الوقت بالطبع عرض التغييرات في قطر السفينة على مر الزمن في 7B الشكل باستخدام برامج مخصصة الصنع-الكشف عن الحافة27. فور الضغط يتوسع السفينة، التي تبعتها انقباض شذوذ نشطة التي تصل إلى مستوى الحالة المستقرة بعد 15 دقيقة إضافة 0Ca2 + هانكس ثم/حل وورتمانين يتوسع السفينة مرة أخرى إلى مستوى مماثل لذلك ولاحظت فورا عقب الخطوة الأولى الضغط. كما هو موضح أعلاه، يجوز تطبيق المخدرات إلى السفن قبل أو الضغط التالية للتحقيق في الآليات الأساسية للتنمية والحفاظ على لهجة شذوذ في هذه السفن. باستخدام هذا النهج، ونحن قد أظهرت سابقا أن تمتد تنشيط قنوات عابرة مستقبلات محتملة فانيلويد 2 (TRPV2) ونوع L و T عن طريق بوابة الجهد Ca2 + قنوات تلعب دوراً محوريا في تسهيل التنمية لهجة شذوذ في أول و وثانيا أمر الفئران الشرايين الشبكية20،،من2122. كما أبلغنا أن كبير الموصلية Ca2 + المنشط البوتاسيوم القنوات (قنوات BK)19،28 و Kvالمحتوية على 1 بوابات الجهد ك+ قنوات القانون معارضة النشاط شذوذ في هذه السفن، منذ إضافة مثبطات محددة لكل من هذه القنوات يطلق تضيق الأوعية (الشكل 7). يبين الشكل 8 أمثلة من Ca2 + التصوير التقليدية و [كنفوكل] في الشرايين الشبكية قبل وبعد التعرض لمضيق للأوعية الببتيد، endothelin-1 (Et-1). في التقليدية fura-2-تعتمد التسجيلات (الشكل 8 أ)، Et 1 (10 نانومتر) يتسبب بزيادة ثنائية الطور في [Ca2 +]أنا في طبقة العضلات الملساء أرتيريولار الشبكية، تتألف من عنصر عابر الأولى تليها أقل استدامة المكون. نحن تميزت سابقا مكونات عابرة ومستمرة بسبب Ca2 + الإصدار من هيولى و Ca2 + تدفق من الفضاء خارج الخلية، على التوالي29. فلوو-المستندة إلى 4 [كنفوكل] Ca2 + تصوير يقدم صورة أكثر تفصيلاً عن آثار Et-1 على المستوى الخلوي. في هذه التجارب، ومن الواضح أن السلس تصنيف التغييرات في العالمية [Ca2 +]أنا لاحظت في الدراسات ميكروفلوريميتري لدينا نتيجة Et-1 تحفيز تنشيط المتكررة غير متزامن [Ca2 +]أنا التذبذبات في خلايا الشبكية العضلات الملساء أرتيريولار المجاورة على طول الجدار السفينة (8B الشكل، ج؛ 30). ويبين الشكل 9 أمثلة من تسجيلات المشبك التصحيح قناة واحدة، وكل خلية من خلايا العضلات الملساء أرتيريولار الشبكية. وحتى الآن، قد نفذنا كل قناة واحدة في الخلية، ومن الداخل إلى الخارج المشبك التصحيح التسجيلات22،28. على سبيل المثال، إظهار الرقم 9 ألف، باء المشبك التصحيح في خلية التسجيل قبل وتمدد غشاء التالية (التي تم إنشاؤها عن طريق تطبيق الضغط السلبي على ماصة التصحيح). يحتوي هذا التصحيح خاصة على اثنين من القنوات التي يتم تنشيطها بامتداد الميكانيكية. وقد أثبتنا سابقا أن هذه التيارات يمكن أن تحول دون استخدام TRPV2 قناة الأجسام المضادة تسد المسام22. الموصلية الوحدوي للقنوات (ملاحظة: 249.71) يتسق أيضا مع هذه التيارات التي توسط TRPV231. يمكن أثارت التيارات تنشيط الجهد كامل الخلية باستخدام البروتوكولات خطوة الجهد. ويبين الشكل 9 عائلة من التيارات K A-نوع+ تنشيط الجهد تسجيلها باستخدام هذا نهج. أصبحت هذه التيارات واضحا عند التيارات الكبيرة الأخرى الموجودة في هذه الخلايا (مثلاً، BK وكاليفورنيا+-تنشيط التيارات Cl– ) يتم حظر استخدام وكلاء الدوائية محددة32،33. ويتم فحص التيارات من خلال قنوات أيون تعتمد على الجهد غير-أو ضعيفة عادة استخدام بروتوكولات منحدر الجهد. لقد استخدمنا هذه البروتوكولات لتحديد وتوصيف التيارات TRPV2 المنشط بناقص التوتر تمتد22 قناة ويضع (الشكل 9) في خلايا العضلات الملساء أرتيريولار الشبكية. يبين الشكل 10 الضغط المزدوج ميوجرافي وتطبق [كنفوكل] Ca2 + تصوير arteriole شبكية الفئران الأولية. ولاحظ ذات المشغلات زيادة تواترi ذبذبات [Ca2 +] في خلايا العضلات الملساء فردية مشابهة لتلك التي Et-1. وقد أظهرنا سابقا أن هذه التذبذبات يتم تشغيلها بواسطة مجموع Ca2 + الشرر (مترجمة Ca2 + الإفراج عن الأحداث)، وتسهم في توليد نغمة شذوذ20. الشكل 1 . الإعداد التجريبية للضغط ميوجرافي في الشرايين الشبكية الفئران. A) المعدات التجريبية بما في ذلك المجهر المقلوب، سخان في خط بيرفوساتي حمام والميكانيكية 3-المحور والمتلاعبين الصغرى، ولكنها، حامل قنية والجدول الهواء. ب) رسم تخطيطي تظهر بالترتيب الأمثل ماصة كانولاتينج وسفينة ذات الفائدة في دائرة التسجيل. كما يوضح هذا الرسم التخطيطي للبنية الأساسية للمعدات ذات. ج) الرسم التخطيطي أظهرت عملية الرسو وتتحرك السفينة باستخدام قسائم سلك التنغستن إضافية في الملقط غرامة. (ط) قطره 1st الانزلاق أوككلودي السفينة. (ثانيا، ثالثا) استخدام قسائم إضافية لدفع أوككلودينج زلة (الاتجاه الذي يشير إليه السهم) ويرافق السفينة في الاتجاه الأمثل هو مبين في (رابعا). د) الرسم التخطيطي عرض الموضع الأمثل أوككلودينج زلة سلك التنغستن وماصة مساعد القنية فيما يتعلق بالسفينة كما رتبت قبل كانوليشن. منفذ شبكة إيصال المخدرات هو المتمركزة على مسافة ~ 500 ميكرومتر من السفينة إلى تقليل حركة القطع الأثرية أثناء تطبيق المخدرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 . عملية كانوليشن للضغوط ميوجرافي. Photomicrographs A) عرض arteriole شبكية الرأسية أسفل في دائرة التسجيل قبل (ط) من خلال (ii)-(v) وكانوليشن التالية (سادسا). سهم أزرق يشير إلى اتجاه حركة القنية بينما السهم الأخضر يشير إلى اتجاه حركة ماصة مساعد. ب) الصورة المجهرية تظهر المنطقة الأمثل لتسجيل نشاط شذوذ أثناء الضغط المميزة باللون الأحمر. ملاحظة، يتيح التكيف من الضوء والتركيز على زيادة على النقيض جدران الأوعية تتبع أفضل لحواف السفن للتحليل الآلي. شريط مقياس يشير إلى 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 . المخدرات التسليم. A) المعدات المستخدمة لإيصال الأدوية عرض الخزانات الحل متصلاً تسليم متعدد القنوات متعددة يسيطر عليها 3-طريقة الصنابير وإرفاقه مناور ميكانيكية 3-المحور. ب) رسم تخطيطي يوضح المواقع الرأسي الأمثل لإيصال المخدرات متعددة فيما يتعلق بدائرة التسجيل. ج) الصورة المجهرية للسفينة الرأسية إلى أسفل في قاعة تسجيل عرض الموضع المثالي لمآخذ توصيل المخدرات. يمثل الشريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 . تسجيل الهضم الأنزيمي للشرايين الشبكية المشبك التصحيح. ضوء ميكروجرافس أرتيريولي الشبكية قبل (A) وبعد الهضم الأنزيمي (ب). ملاحظة الانفصال الجسدي (المشار إليها بواسطة الأسهم) من خلايا العضلات الملساء (سمكس) من خلايا بطانية الكامنة (ECs). يتم الإشارة إلى خلايا العضلات الملساء مناسبة لقط التصحيح بعلامة نجمية. يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5 . واحدة القناة وتسجيل المشبك التصحيح خلية كله. لاحظ التوضيح A) التيارات الاختبار خلال بروتوكول ‘ختم اختبار’ عندما: (ط) ماصة التصحيح يدخل المتوسطة الاستحمام الخارجية، نصيحة ماصة (ثانيا) يأتي في اتصال مع غشاء بلازما الخلية العضلات الملساء والأوعية الدموية و (ثالثا) شفط تطبيق على الجزء الخلفي ماصة لتمكين تكوين جيجاسيل. وبعد ماصة تعويض السعة باستخدام مكبر للصوت المشبك التصحيح، التيارات قناة واحدة الآن قد يكون تسجيل في التكوين في الخلية أو قد اقتطعت تصحيحًا للغشاء بسرعة سحب الماصة لإنشاء تصحيح ‘من الداخل إلى الخارج’. مثقب ب) التغييرات الحالية المرتبطة بتطوير الوصول الكهربائية إلى داخل الخلية أثناء تطبيق كل الامفوتريسين ب-الخلية التصحيح المشبك تقنية (ط): (الثاني) بالوصول إلى أقسام الامفوتريسين بفي الغشاء، شلالات المقاومة والسعة العابرين أثارت خلال هايبربولاريزينج خطوات الجهد الكهربي (من-40 إلى-60 mV) تصبح أكبر؛ (ثالثا) بمجرد وصول المقاومة (ص) انخفض إلى < 15 MΩ، التي عادة ما يستغرق 5-10 دقيقة بعد تشكيل جيجاسيل، من الممكن التجريب. ويجب تعويض ج) قبل تسجيل كامل الخلية والوصول إلى المقاومة والسعة الخلية باستخدام الأوجه ذات الصلة على مكبر للصوت المشبك التصحيح. يمكن استخدام قيم السعة المقاومة وخلية الوصول المقدمة من الوظائف الآلية ضمن برامج التصحيح-المشبك للمساعدة في توجيه هذه العملية: (ط) يظهر السعة عابرة قبل تعويض مأخوذة من المنطقة المبرزة في تحقيق الآتي؛ (ثانيا) يظهر الحد في السعة عابر يلاحظ عادة عندما يتم التعويض عنها بالوصول إلى المقاومة والسعة؛ (ثالثا) التعويض المقاومة سلسلة ينبغي تصحيحه ثم يصل إلى 75% والوصول إلى المقاومة وتعويضات السعة صقل أن عابرة الناتج ينبغي أن يكون نسبيا متساوية في السعة أعلاه وتحت مستوى الهضبة الحالية خلال الخطوة. (رابعا) ينبغي الحرص لضمان أن المقاومة الوصول لا يعوض ما يزيد على (المشار إليها بسبب وجود ‘طنين’ لعابر)، التي يمكن أن تحدث في بعض الأحيان إذا كان الوصول إلى تواصل التحسن خلال فترة التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 6 . تحديد الشرايين الشبكية الفئران المعزولة. A) رسم توضيحي يبين ترتيب شجرة microvascular الشبكية الفئران. ب) صور [كنفوكل] الفئران الشبكية الشرايين والاوردة داخل جبل مسطح الاستعدادات الملون ل αSMA (الأحمر نويات ملطخة الأزرق؛ وتمثل الأشرطة مقياس 50 ميكرومتر). ج) ميكروجرافس الخفيفة المعزولة ° 1، 2 ° والشرايين الشعرية قبل، شبكة الشعرية وفينلي (أشرطة مقياس تمثل 10 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 7 . تسجيلات ميوجرافي ضغط أرتيريولار. صور A) لعرض مقني arteriole الشبكية (ط) يستريح القطر (حوالي 35.6 ميكرومتر)، (ثانيا) تمدد عند الضغط، (ثالثا) تطوير شذوذ تضيق الأوعية وتمدد (الرابع) بسبب إضافة 10 ميكرون وورتمانين في 0Ca2 + الحل هانكس. مقياس بار يمثل 10 ميكرون. ب) وقت الدورة مؤامرة قطر السفينة للتجربة الكاملة سيظهر في ألف (التي أخذت عيناتها في إطارات 2.5/s). قطر ج) تتبع من arteriole مختلفة تحت لهجة شذوذ حالة ثابتة (القطر 38.7 ميكرومتر) تظهر آثار كوريوليدي المانع قناة Kv1 (10 ميكرون) وإيبيريوتوكسين المانع قناة BK (100 nM) (التي أخذت عيناتها في 0.5 إطارات/ثانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 8 . آثار Et-1 [Ca2 +] أنا مما يشير إلى النشاط في الشرايين الشبكية الفئران. A) التقليدية fura-2-تعتمد تسجيل عرض آثار Et-1 (10nM) في العالم [Ca2 +]أنا. بصل [Ca2 +]أنا كان 82 شمال البحر الأبيض المتوسط في هذا أرتيريولي 1 °. ب) فلوو-4-تعتمد xt [كنفوكل] صور تظهر آثار Et-1 على [Ca2 +]أنا على المستوى الخلوي. ج) الأرض من شدة الأسفار تطبيع (F/F0) تقاس في الخلايا كما تميز في باء. وقد تم تعديل هذا الرقم من توميلتي et al. 30 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 9 . قناة واحدة وتسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من خلايا العضلات الملساء أرتيريولار الشبكية الفئران. ، ب) تسجيلات قناة واحدة في الخلية من غشاء نفس التصحيح قبل (A) وخلال (ب) تطبيق ضغط سلبي (-45 ملم زئبق) للتصحيح “الماصة؛”. قناتين موجودة في التصحيح (12.81 الحالي الوحدوي السلطة الفلسطينية؛ والوحدوي الموصلية 249.71 pS) التي تبين حدوث زيادة كبيرة في تفعيل ظروف تمتد. (ط) يتم عرض مناطق مختارة من الأفرقة علوية في أسرع وقت قاعدة في الألواح السفلي (ثانيا). الأسرة ج) التيارات قناة K A-نوع+ (ط) سجلت في وضع خلية كله وجود مثبطات BK و Ca2 +-تنشيط مثبطات قناة Cl– ، وأثارت استجابة للجهد المتوسط 20 خطوة زيادات بين-80 أم إلى + 80 mV (ثانيا). د) خلية كل التيارات (ط) حظيت بسلالم الجهد بين-80 mV و + 80 أم قبل (الخط الأسود) وأثناء التطبيق (الخط الأحمر) TRPV2 قناة مؤثر مادة الدلتا-9-تتراهيدروكانابينول (Δ9–التتراهيدروكانابينول). ويرد البروتوكول منحدر الجهد المستخدمة في اللوحة السفلي (ثانيا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 10 . Ca2 + [كنفوكل] التصوير قبل وبعد الضغط الفئران arteriole الشبكية. أونبريسوريزيد xt [كنفوكل] الممثل بالأشعة (ط) من خلايا العضلات الملساء أرتيريولار الشبكية تحت (أ) والضغط (ب) الشروط التي تم الحصول عليها من مناطق منفصلة من السفينة نفسها. (ثانيا) التغييرات في تطبيع الفلورية (F/F0) الخلايا الفردية المسجلة في أ-ه، كما هو مبين في (ط) تآمروا ضد الوقت. تشير العلامات النجمية الفردية سوبسيلولار Ca2 + الشرر التي زيادة في تواتر بعد الضغط وسامات لتشغيل Ca2 + الذبذبات الخلوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- مجمع (مم) انخفاض Ca2 + هانكس 0Ca2 + هانكس هانكس العادي عزل إنزيم البروتياز عزل إنزيم كولاجيناز عزل إنزيم الدناز إخماد الحل الحل رمين الحل رماكس خلية يولي الحل خارج الخلية خلية يولي ماصة الحل حل كامل الخلية خارج الخلية حل كامل الخلية الماصة نقاء المياه (المقاومة) MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان إيت MΩ.cm إيه وان فايف MΩ.cm إيه وان إيت كلوريد الصوديوم 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 بوكل 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138 د-الجلوكوز 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 مجكل2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1 حبيس 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 كاكل2 0.1 2 0.1 0.1 0.1 10 2 2 2 0.2 عطا 4 0.5 الحركة 10 إيونوميسين 0.01 كوه 140 130 حمض الغلوكونيك د 130 130 هيدروكسيد الصوديوم 10 بينيتريم أ 0.0001 0.0001 0.0001 4-أمينوبيريديني 10 نيموديبين 0.01 0.01 فلوكستين 0.1 9-أنثراسينيكاربوكسيليك حامض 1 الامفوتريسين B 300-600 ميكروغرام مل-1 مبطلات النوع الرابع عشر ~0.01% (0.4-0.6 ملغ/40 مل) كولاجيناز نوع 1A 0.1% (6 مغ/60 مل) الدناز أنا كو 20 (20 ميكروليتر من الأسهم MU/mL 1 في 20 مل) الأس الهيدروجيني 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2 معاير مع هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم تريس تريس هيدروكسيد الصوديوم كوه الجدول 1- تكوين الحلول المستخدمة في التجريب بما في ذلك أمثلة للخارجية واستخدام الحلول ماصة لقناة واحدة (TRPV2) وخلية كل التيارات (A-نوع).
Discussion
البروتوكولات المذكورة أعلاه تتطلب الممارسة ولكن ينبغي أن تكون قابلة للتحقيق مع الحد الأدنى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. في يوم في متوسط كنا الحصول على 6-8 الشرايين قابلة للاستخدام من العزلة وتحقيق تجارب ناجحة 3-4. في حالة مواجهة مشاكل، ومع ذلك، هناك بعض الخطوات التي يمكن اتخاذها للمساعدة على تحسين معدلات النجاح. أحياناً قد وجدنا، خاصة عند استخدام الفئران الأصغر سنا (< 8 أسابيع)، أن عائد الشرايين يمكن أن تكون منخفضة. ونقترح للتحايل على هذه المشكلة، سينتريفوجينج نسيج الشبكية (10-30 ثانية في 500 س ز) بين كل من تريتوريشن الخطوات في الخطوات 1.12-1.14. هذا غالباً ما يساعد على تحسين عائد السفن ولكن أيضا زيادة في كمية الحطام خلية ضمن الإعداد.
عندما كانولاتينج السفن للدراسات ميوجرافي الضغط من المهم فحص الشرايين بعناية لأي الفروع الجانبية التي قد يكون تم المشقوق قريبة من الموقع التشعب. وهذا يمثل قضية مشتركة من التسرب وفقدان الضغط أثناء التجريب. والمسألة الرئيسية التي يمكن أن تنشأ مع [Ca2 +]أنا البروتوكولات هو مستوى صبغ تحميل. تحميل صبغ الفقيرة يؤدي إلى انخفاض نسب إشارة إلى الضوضاء، أثناء التحميل الزائد للنتائج في اضطراب Ca2 + التوازن الطبيعي. للحد من احتمال وقوع أي من هذه القضايا، يمكن إزالتها قاسمة صغيرة من هوموجيناتي الشبكية، وفحص السفن معزولة بشكل دوري أثناء تحميل البروتوكول. عندما تعهد المشبك تصحيح التجارب، معدل نجاح تشكيل جيجاسيل تعتمد اعتماداً كبيرا على كيفية جيدا قد تم هضمها الصفيحة القاعدية. عندما في البداية اختبار هذا البروتوكول أو استخدام الجديد الكثير من الإنزيمات قد يكون ضروريا لضبط التركيز/مدة إنزيم الهضم. رصد بدقة الفصل بين الطبقات بطانية والعضلات الملساء سيكفل الهضم كافية لإزالة ما فيه الكفاية القاعدية لامينال الحصول على حق الوصول. الرصد الدقيق ضروري أيضا لتجنب الإفراط الهضم، والتي يمكن أن تظهر كالسفينة ويبدأ بانقباض. في حالة حدوث ذلك، خلايا العضلات الملساء غالباً ما تكون هشة جداً لتسجيل المشبك التصحيح. عند تطبيق الإنزيمات، من المهم أن تشمل الدناز الأول لضمان التخلص خيوط من الحمض النووي المحررة من تلف الخلايا أثناء عملية العزل. شظايا من الحمض النووي هي لزجة وتسبب الملقط على التمسك arteriole أثناء المراحل النهائية من عملية التنظيف (الخطوة 4، 4)، غالباً ما يؤدي إلى فقدان السفينة. تنظيف السفن أمر صعب من الناحية التقنية وهو القيام بأفضل في تضخم عالية (20 س) مع اقتراحات كاسحة لطيف الملقط مغلقة من قطر نصيحة ممكن خيرة. بين الاحتلالات، نظيفة لفة الملقط مع مختبر.
كما أكد في وقت سابق، كان أحد دوافع رئيسية وراء تطوير البروتوكولات المبينة في هذه المخطوطة إلى فهم أفضل لماذا تعطل تدفق الدم أثناء أمراض الأوعية الدموية الشبكية. معظم أعمالنا حتى الآن قد ركزت على العين السكري مرض28،33. يمكن أن تكون الشرايين معزولة من شبكية العين لنماذج القوارض تجريبية لمرض السكري باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 1. عند تجريب في الشرايين الشبكية المعزولة من الحيوانات السكري، من المهم في محاولة لتكرار الظروف hyperglycemic تتعرض السفن في فيفوعن كثب. لهذا السبب، فإننا سوف عادة رفع مستويات د-الجلوكوز في العزلة والحلول التجريبية إلى 25 مم. سماكة الأغشية الطابق السفلي والأوعية الدموية ظاهرة المعترف بها جيدا في الأوعية الشبكية أثناء مرض السكري34،35. عند استخدام الحيوانات المصابين بالسكري المطول (> 1 أشهر مدة المرض)، إنزيم زيادة تركيزات أو أوقات الهضم كثيرا ما يلزم لتمكين تطبيق أساليب تسجيل التصحيح-المشبك.
قيداً هاما من استخدام السابقين فيفو معزولة الشرايين الشبكية لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية الشبكية والفيزيولوجيا المرضية هو فقدان نيوروبيلي الشبكية المحيطة بها. على الرغم من أن إزالة الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الشبكية يتيح سهولة الوصول إلى خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية الشبكية للدراسات فيزيولوجيا الخلية، استجابة السفن للوسطاء فعال في الأوعية يمكن أن تغير بشكل كبير في غياب وحضور الشبكية الأنسجة. إجراءات ثلاثي فوسفات الادينوسين (ATP)، على سبيل المثال، تقدم مثالاً جيدا لهذه النقطة. في عزلة الفئران الشرايين الشبكية، بالإضافة للمشغلات ATP انقباض قوية من سفن36، بينما في وجود نيوروبيلي سليمة، تمدد الأوعية37. ولذلك، حيثما كان ذلك ممكناً، ونحن عادة في محاولة للتحقق من صحة النتائج الرئيسية المستخلصة من استعداداتنا arteriole المعزولة باستخدام السابقين فيفو الشبكية كل–يتصاعد والقياسات في فيفو من سفينة القطر والدم تدفق16،37 . من المذكرة، أساليب جديدة ظهرت مؤخرا لدراسة الشرايين الصغيرة والشعيرات الدموية في شبكية العين الخنزير كله perfused السابقين فيفو38،39. هذه الاستعدادات من المحتمل إلى حد كبير تحسين فهمنا كيف ينظم نيوروبيلي الشبكية الشبكية لهجة أرتيريولار والشعرية وكيف تعدل التغييرات في هايموديناميكس الشبكية نشاط الخلايا العصبية في الشبكية.
على الرغم من أن الإجراءات المذكورة في هذه الورقة تركز على استخدام الفئران المعزولة الشرايين الشبكية لفهم فيزيولوجيا الخلية العضلات الملساء أرتيريولار، ونحن حاليا بوضع بروتوكولات لتمكين أيضا دراسة وظيفة الخلايا البطانية في هذه السفن. في العمل التمهيدي، نجحنا في تعديل الهضم الأنزيمي من شرائح أرتيريولار الشبكية لإنتاج أنابيب الخلايا غشائي قابلة للحياة التي قابلة ل Ca2 + تصوير وتسجيل الدراسات باتشكلامب. Cannulation الشرايين معزولة في كلا طرفي، تمكين التسليم إينترالومينال المخدرات، ويمكن في المستقبل أيضا تمكين البطانة تعتمد على الردود فاسوديلاتوري التحقيق في هذه السفن.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد تطوير البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة من المنح المقدمة من وكالات التمويل التالية: بسرك (BB/I026359/1)، والكفاح من أجل البصر (1429 و 1822)، مؤسسة أبحاث مرض السكري الأحداث (2-2003-525)، ومؤسسة ويلكوم ترست (074648/Z/04)، مؤسسة القلب البريطانية (جزء من الغرام/11/94/29169) التطوير HSC د شعبة (STL/4748/13) ولجنة نهر الميكونج (MC_PC_15026).
Materials
| Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
| Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
| Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
| Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
| Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
| Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
| Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
| Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
| Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
| Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
| Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
| Pressure myography | |||
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
| Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
| Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Patch clamping | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
| Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
| Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
| Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
| Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Ca2+ imaging | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
| x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
| Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
| Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
| On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
| Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |
Referências
- Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
- Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
- Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?. Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
- Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
- Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
- Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
- Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
- Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
- Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
- Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
- McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
- Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
- Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording, Second Edition. , 53-90 (1995).
- Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
- McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
- Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
- McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
- McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
- Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
- Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
- Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
- P, S. k. o. v. . J. e. n. s. e. n. ., S, M. e. t. z. . M. a. r. i. e. n. d. a. l. . P. e. d. e. r. s. e. n., Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).
Citar este artigo
Curtis, T. M., McLaughlin, D., O’Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).