पूर्व Vivo सेल फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए रेटिना धमनियों का अलगाव
1Centre for Experimental Medicine,Queen’s University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education),Queen’s University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy,Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences,Queen’s University of Belfast
Summary
इस पांडुलिपि चूहे रेटिना कि electrophysiological, कैल्शियम इमेजिंग और दबाव myography अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता से धमनियों के अलगाव के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
रेटिना एक अत्यधिक चयापचय सक्रिय ऊतक है कि एक पर्याप्त रक्त की आपूर्ति की आवश्यकता है । रेटिना परिसंचरण भीतरी रेटिना का समर्थन करता है, जबकि धमनियां जहाजों photoreceptors की आपूर्ति । रेटिना छिड़काव में परिवर्तन मधुमेह रेटिनोपैथी, मोतियाबिंद और रेटिना शाखा नस occlusions सहित कई दृष्टि धमकी विकारों, के लिए योगदान. आणविक रेटिना के माध्यम से रक्त के प्रवाह के नियंत्रण में शामिल तंत्र को समझना और कैसे इन नेत्र रोग के दौरान बदल रहे है इन शर्तों के उपचार के लिए नए लक्ष्य की पहचान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । रेटिना धमनियों रेटिना के मुख्य प्रतिरोध वाहिकाओं हैं, और फलस्वरूप, चमकदार व्यास में परिवर्तन के माध्यम से रेटिना hemodynamics को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. हाल के वर्षों में, हम चूहे रेटिना जो सेल फिजियोलॉजी अध्ययन सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है से धमनियों अलग करने के लिए तरीके विकसित किया है । यह तैयारी पहले से ही कैसे रक्त प्रवाह रेटिना में नियंत्रित है और हमें महत्वपूर्ण परिवर्तन है कि नेत्र रोग के दौरान होने के कुछ की पहचान करने की अनुमति दी है में नए अंतर्दृष्टि उपज शुरू कर दिया है । इस अनुच्छेद में, हम चूहे रेटिना धमनियों के अलगाव के लिए तरीकों का वर्णन और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम इमेजिंग और दबाव myography अध्ययन में उनके उपयोग के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं । इन जहाजों को भी पीसीआर में उपयोग के लिए उत्तरदायी हैं, पश्चिमी सोख्ता-और immunohistochemistry आधारित अध्ययन.
Introduction
समझ कैसे रक्त प्रवाह रेटिना में नियंत्रित किया जाता है एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है, के बाद से असामांय रक्त प्रवाह दृष्टि की एक किस्म के रोगजनन में फंसा दिया गया है-धमकी रेटिना रोगों1,2,3, 4. रेटिना परिसंचरण, जो भीतरी रेटिना न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की आपूर्ति, एक अंत धमनी व्यवस्था है, रेटिना धमनियों और धमनियों से रक्त के सभी के साथ रेटिना venules करने के लिए केशिकाओं के माध्यम से गुजर रहा है और अंत में5नसों. रेटिना में रक्त का प्रवाह रेटिना की धमनियों और धमनियों के टोन द्वारा विनियमित है और साथ ही रेटिना केशिकाओं और पोस्ट-केशिका venules6,7की दीवारों पर स्थित pericytes की सिकुड़ा गतिविधि है, 8. रेटिना संवहनी टोन के नियंत्रण जटिल है और संचार प्रणाली और आसपास के रेटिना ऊतक, रक्त गैसों सहित से आदानों की एक श्रृंखला द्वारा संग्राहक है, अणु और हार्मोन घूम रहा है, और vasoactive पदार्थों से जारी रेटिना संवहनी endothelium और macroglia9,10,11. रेटिना धमनियों रेटिना की छोटी धमनी शाखाओं रहे हैं और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की एक परत से बना रहे हैं और longitudinally की व्यवस्था की भीतरी अस्तर endothelial कोशिकाओं12,13, 14. इन जहाजों रेटिना परिसंचरण के भीतर संवहनी प्रतिरोध की मुख्य साइट के रूप में और इसलिए रेटिना रक्त प्रवाह के स्थानीय नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रेटिना धमनियों का फैलाव या उनके चमकदार व्यास कसना द्वारा रेटिना में केशिका रक्त प्रवाह को विनियमित, संवहनी चिकनी मांसपेशी सिकुड़ना10,15,16में परिवर्तन के द्वारा मध्यस्थता । आणविक तंत्र को समझना जिसके माध्यम से रेटिना धमनियों रेटिना को विनियमित छिड़काव इसलिए तैयारी की आवश्यकता है जहां arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं तक पहुँचा जा सकता है और संभव के रूप में शारीरिक के करीब के रूप में स्थितियों में अध्ययन किया.
पूर्व vivo अलग रेटिना रक्त वाहिकाओं की तैयारी संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के लिए पहुँच प्रदान करते हैं, whilst अभी भी उनकी कार्यक्षमता और अंतर्निहित endothelium के साथ संपर्क बनाए रखने. अलग जहाजों का उपयोग करने की तारीख करने के लिए अधिकांश अध्ययनों बड़े गोजातीय या सुअर का धमनी वाहिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है (६०-१५० µm). ये व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तार या दबाव myograph प्रणालियों में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका सिकुड़ा तंत्र17,18के औषधीय पूछताछ सक्षम करने के लिए मुहिम शुरू की जा सकती है । इस तरह की तैयारी बहुत सामांय परिस्थितियों में रेटिना संवहनी फिजियोलॉजी के हमारे ज्ञान के लिए योगदान दिया है । कुछ अध्ययनों रेटिना धमनियों अपने छोटे व्यास के रूप में छोटे प्रयोगशाला जानवरों से अलग इस्तेमाल किया है (~ 8-45 µm) पारंपरिक myography प्रणालियों में उनके उपयोग को रोकता है19,20,21,22. एक महत्वपूर्ण लाभ, तथापि, छोटे प्रयोगशाला पशुओं से जहाजों का उपयोग कर के आनुवंशिक रूप से संशोधित, ट्रांसजेनिक और रेटिना रोग मॉडल की व्यापक उपलब्धता है । छोटे प्रयोगशाला जानवरों को भी अधिक vivo हस्तक्षेप अध्ययन में के लिए उत्तरदाई हैं ।
यहाँ हम अलग और दबाव myography प्रयोगों के लिए cannulating चूहे रेटिना धमनियों के लिए सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन. Ca2 + इमेजिंग और इन जहाजों का उपयोग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल भी विस्तृत रहे हैं । ये संवहनी चिकनी मांसपेशी सिकुड़ना और रेटिना में रक्त के प्रवाह के विनियमन में और अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
Protocol
सभी प्रयोगों यहां वर्णित ब्रिटेन जानवरों (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) के भीतर निहित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया १९८६ के अधिनियम और बेलफास्ट पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा शरीर की रानी विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया । 1. रेटिना धमनियों का अलगाव नोट: निम्न प्रोटोकॉल रेटिना धमनियों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस विधि चूहे रेटिना धमनियों के लिए अनुकूलित है, लेकिन माउस रेटिना के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, जहाजों की उपज कम है, जब चूहों का उपयोग कर । कम Ca2 + युक्त हैंक्स ‘ (LCH) का एक समाधान बनाने के रूप में 1 तालिकामें दिखाया गया है ।नोट: इस समाधान के लिए 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (जब संग्रहीत LCH का उपयोग कर, सुनिश्चित करें कि यह कमरे के तापमान के लिए equilibrates और पीएच उपयोग करने से पहले सही है) । रेटिना की तेजी से microdissection सुनिश्चित करने के लिए ऊतक के संग्रह से पहले निम्नलिखित उपकरणों को इकट्ठा: दांतेदार संदंश, घुमावदार कैंची, विच्छेदन पकवान (सिलिकॉन लेपित पेट्री पकवान), एकल धार ब्लेड, संदंश के 2 सेट (कुंद) 1 ग्लास पाश्चर पिपेट (आग एक चिकनी लेकिन नहीं संकीर्ण टिप को पॉलिश), 1 डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट (टिप के साथ छंटनी के लिए एपर्चर को बढ़ाने के लिए ~ 5-7 mm), 1 ग्लास दौर नीचे टेस्ट ट्यूब (5 मिलीलीटर) और धारक । एक गिलास चोंच में LCH के लगभग ५० मिलीलीटर खिचड़ी भाषा और एक दूसरा चोंच बेकार तरल पदार्थ के लिए तैयार करना ।नोट: निर्दिष्टीकरण और निर्माता विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें. Euthanize2 का उपयोग कर चूहे exsanguinate को हृदय पंचर द्वारा पीछा किया (ग्रीवा अव्यवस्था या हिलाना से बचने के रूप में इन आंखों में रक्त वाहिकाओं को नुकसान हो सकता है) । दांतेदार संदंश के साथ पलकें वापस लेना, तो घुमावदार कैंची का उपयोग करने के लिए कक्षीय मांसपेशियों के आसपास और ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से कटौती । धीरे से आंखों से निकालने की देखभाल करने के लिए कैंची के साथ किसी भी शेष संलग्नक के माध्यम से कटौती की कक्षा । आंखों को विच्छेदन पकवान पर LCH समाधान में डूबे रखें (आंखें यदि आवश्यक हो तो LCH के समाधान में बर्फ पर जाया जा सकता है) । कुंद संदंश के एक सेट का प्रयोग करें कक्षीय मांसपेशी संलग्नक या ऑप्टिक तंत्रिका धारण द्वारा पकवान को आंख लंगर; सुनिश्चित करें कि एंकरिंग पॉइंट के रूप में श्वेतपटल को आंखों को स्थिर करने के लिए संभव के रूप में बंद है । ब्लेड का प्रयोग, ora serrata साथ कॉर्निया के माध्यम से कट और संदंश के साथ श्वेतपटल पर धीरे दबाकर लेंस हटा दें । ऑप्टिक डिस्क के माध्यम से आधे में नेत्र कप में कटौती । का प्रयोग बंद संदंश धीरे ‘ ब्रश ‘ eyecup के दो हिस्सों से रेटिना बाहर करने के लिए ऑप्टिक डिस्क पर किसी भी शेष संलग्नक को दूर करने के लिए देखभाल ले । दूसरी आंख के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ और प्लास्टिक पिपेट और LCH माध्यम की एक छोटी सी बूंद का उपयोग कर परीक्षण-ट्यूब में विच्छेदित रेटिना हस्तांतरण. प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करना LCH के साथ परीक्षण ट्यूब को भरने ~ 5 मिलीलीटर और रेटिना को नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं । ऊतक लगभग 3 बार निकालने से ~ समाधान के 4 मिलीलीटर ट्यूब से और जोड़ने ताजा LCH प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर । जहां आवश्यक हो, ऐसे suspensory बंधन, अवलेह हास्य और बाल के रूप में बाहरी ऊतक निकालें । कांच के अंदर की पाश्चर पिपेट (पॉलिश्ड टिप) को LCH के साथ पिपेट से चिपकने से ऊतक को रोकने के लिए धो लें । एक ही पिपेट का प्रयोग, परीक्षण-ट्यूब से समाधान के लगभग 4 मिलीलीटर हटा दें । फिर ताजा LCH के लगभग 2 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे अलग कर देना (triturate) ग्लास पिपेट के टिप के माध्यम से ऊतक ड्राइंग द्वारा रेटिना धीमे और परीक्षा में सामग्री निष्कासित-ट्यूब । ध्यान दें, इस स्तर पर बुलबुले परिचय नहीं करने की कोशिश । दोहराएं चरण १.१० तक रेटिना को लगभग 2-3 mm2का एक आकार के लिए टूट रहे हैं । LCH के लगभग 2 मिलीलीटर के साथ पिपेट के अंदर धोने और परीक्षण-ट्यूब में इस निष्कासित । सामग्री 5-10 मिनट से अधिक नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें । trituration प्रक्रिया के रूप में १.१०-१.१२ में उल्लिखित के रूप में एक छोटे से अधिक बल के साथ जब तक ऊतक टुकड़े आकार में लगभग 1 मिमी2 रहे हैं । फिर, ऊतक 5-10 मिनट के लिए बसने के लिए अनुमति देते हैं । दोहराएँ चरण १.१०-१.१२ सामग्री पूरी तरह से homogenized और रेटिना के कोई टुकड़े रह रहे हैं जब तक अधिक बल के साथ एक तीसरी बार (समाधान दिखने में दूधिया हो जाना चाहिए).नोट: इस तकनीक को 8 arteriolare क्षेत्रों को उपज (अपेक्षाकृत मुक्त आसपास के neuropile और कुछ शाखाओं के साथ बरकरार शेष) के प्रति अलगाव मापने 8-45 µm व्यास में और २००-२५०० µm लंबाई में । एक शारीरिक रिकॉर्डिंग चैंबर में अलग की एक छोटी मात्रा हस्तांतरण या intracellular ca2 + एकाग्रता ([ca2 +]मैं; अनुभाग 3 देखें) की माप के लिए फ्लोरोसेंट रंजक जोड़ें । आंख कप के अवशेष के निपटान और समाधान पशु अपशिष्ट की हैंडलिंग पर स्थानीय नियमों के अनुसार अलगाव की प्रक्रिया के दौरान हटा दिया ।नोट: जबकि यह जहाजों पर प्रयोग करने के लिए सलाह दी जाती है तुरंत अलगाव के बाद, अधिशेष अलग 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । २. Arteriolar दाब Myography नोट: Arteriolar दबाव myography के रूप में चित्रा 1a, बी और सामग्री की मेजमें विस्तृत उपकरणों का उपयोग कर निम्नानुसार किया जाता है । रेटिना पोत homogenate (1-2 एमएल; खंड 1 के अनुसार पृथक) एक शारीरिक रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए एक aliquot स्थानांतरण (आंशिक रूप से नाममात्र Ca के साथ भरा2 +मुक्त हैंक्स ‘ समाधान; 0Ca2 + हैंक्स ‘; तालिका 1देखें) एक के मंच पर घुड़सवार उल्टे माइक्रोस्कोप । जहाजों छोड़ने के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर के नीचे से कम 5 मिनट के लिए प्रयोग करने से पहले व्यवस्थित । नेत्रहीन रिकॉर्डिंग चैंबर भर में स्कैन धमनियों की पहचान करने के लिए > २०० µm लंबाई में और एक खुला अंत रखने के माध्यम से पोत cannulated जा सकता है (पोत प्रकार की पहचान आगे परिणाम अनुभाग में पता लगाया है). दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में पोत की स्थिति । यदि कोई उपयुक्त जहाजों मौजूद हैं, २.१ कदम के अनुसार रिकॉर्डिंग चैंबर में पोत homogenate का एक और aliquot हस्तांतरण । लंगर ठीक संदंश और एक छोटे टंगस्टन तार पर्ची का उपयोग पोत के एक छोर (७५ µm व्यास और ~ 2-4 मिमी लंबाई में) पोत पर रखा ( चित्रा 1C(मैं) देखें) । ऐसा करने के लिए संदंश में तार पकड़ और रिकॉर्डिंग चैंबर के ऊपर संदंश का पता लगाने । खुर्दबीन के नीचे संदंश की इसी छाया की पहचान, स्नान में संदंश कम जब तक तार स्पष्ट हो जाता है । पोत पर तार की स्थिति लगभग २०० खुले अंत से µm और जहाज की लंबी धुरी को सीधा तार ड्रॉप ।नोट: टंगस्टन तार का वजन cannulation और प्रणा के दौरान चमकदार सामग्री के पोत को लंबा रोक प्रवाह बंद करना करने के लिए पर्याप्त है । इस तरह की है कि यह प्रणा प्रवेशनी के साथ लाइन में खुले अंत के साथ स्नान भर में क्षैतिज निहित है कि रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर एक उपयुक्त स्थिति में arteriole हटो ( चित्रा 1C(द्वितीय-iv) देखें) । धीरे संदंश के भीतर आयोजित तार की एक अतिरिक्त अनुभाग के साथ occluding टंगस्टन तार पर्ची परोक्ष दबाव डाल द्वारा यह मत करो; arteriole को स्पर्श न करें क्योंकि यह संदंश का पालन अचल करेगा । जहां आवश्यक (लंबे arteriole क्षेत्रों के लिए), अतिरिक्त टंगस्टन तार जोड़ें पोत पर फिसल जाता है कि पोत के occluded और खुले छोर के बीच की दूरी २०० µm से अधिक नहीं है; यह प्रणा पर देखने के क्षेत्र से बाहर चलती arteriole को रोकने में मदद करता है । यदि पोत के पास कोई ओर शाखाएं हैं तो इन पर अतिरिक्त टंगस्टन वायर स्लिप के साथ occluded भी होना चाहिए । यदि एक ओर शाखा को पोत occluded नहीं किया जा सकता । Perfuse 0Ca के साथ चैंबर2 + हैंक्स ‘ पर ३७ डिग्री सेल्सियस बाहरी रेटिना ऊतक निकालने के लिए और शारीरिक तापमान के लिए स्नान गर्म करने के लिए.नोट: एक मानक गुरुत्वाकर्षण खिलाया स्नान छिड़काव और में लाइन हीटर प्रणाली इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्र 1aदेखें) । 0Ca2 + हैंक्स ‘ cannulation प्रक्रिया की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है, के बाद से हटाने के बाहरी Ca2 + धमनियों फैली हुई है कि यह सुनिश्चित करता है । किर प्रणा cannulas से रेशा borosilicate कांच केशिकाओं (टिप व्यास ~ 3-10 µm पोत के व्यास के आधार पर cannulated किया जाना है; छोटे जहाजों को संकरा cannulas की आवश्यकता होती है; सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर एक microelectrode खींचने और 0Ca2 + हैंक्स ‘ समाधान के साथ वापस भरें । प्रवेशनी की टांग सुनिश्चित करने के लिए cannulation की सुविधा के लिए टिप की ओर धीरे पतला है । माउंट एक पिपेट एक वाई-कनेक्टर और एक 3 तरह से नल के माध्यम से एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी धारक में प्रवेशनी; इस प्रणाली दबाव करने के लिए प्रयोग किया जाता है, दबाव Y-कनेक्टर के दूसरे पक्ष के हाथ से जुड़ी एक manometer का उपयोग कर दर्ज किया जा रहा ( चित्र 1bदेखें) ।नोट: cannulation प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए एक ‘ हेल्पर ‘ पिपेट की आवश्यकता होती है । एक borosilicate ग्लास केशिका से पिपेट गढ़े ०.५-2 µm के एक टिप व्यास को एक microelectrode खींचने पर खींच लिया । भारी आग पिपेट पॉलिश (अक्सर बंद जब तक) एक microforge का उपयोग कर । ध्यान से एक 3-अक्ष यांत्रिक जोड़तोड़ का उपयोग कर खुले अंत करने के लिए पोत के करीब लंबी धुरी को सही कोण पर सहायक पिपेट की स्थिति ( चित्र 1 d) देखें । बस पोत के ऊपर सहायक पिपेट स्थिति है, लेकिन यह छू नहीं है । पोत के खुले छोर पर cannulation पिपेट की स्थिति ( चित्रा 1 डी और 2a(मैं)) एक ठीक micromanipulator का उपयोग कर देखें; स्थिति टिप तुरंत खोलने के लिए आसंन, के रूप में माइक्रोस्कोप पर ध्यान के विमान का समायोजन करके मूल्यांकन (20X पर) । जब दोनों पोत और प्रवेशनी टिप के अंत में एक ही समय में प्रवेशनी सही ढंग से cannulation के लिए तैनात है पर ध्यान में है ( चित्रा 2a(द्वितीय) देखें) । अग्रिम प्रणा प्रवेशनी पोत एपर्चर में x-अक्ष ठीक micromanipulator के नियंत्रण का उपयोग कर ( चित्रा 2a(iii) देखें) । y-अक्ष के साथ प्रवेशनी ले जाकर cannulation की सफलता का आकलन करें । यदि प्रवेशनी पोत के भीतर रहता है यह सफलतापूर्वक cannulated है ( चित्रा 2a(iv) देखें) । यदि प्रवेशनी पोत के बाहर चलता है, प्रवेशनी पोत के ऊपर होने की संभावना है; यदि ऐसा है तो दोहराएँ चरण २.१०-z-अक्ष में एक कम विमान में प्रवेशनी के साथ २.११. पर सफल cannulation धीरे सहायक पोत पर पिपेट कम arteriole को नियंत्रित करने के लिए । सहायक पिपेट के साथ प्रणा प्रवेशनी पर arteriolar दीवार गाइड, cannulation पिपेट के रूप में एक ही समय में आगे पोत लुमेन में लगभग 30-50 µm की दूरी के लिए उंनत है ( चित्रा 2a(v, vi) देखें) ।नोट: यह प्रक्रिया एक साथ, दोनों जोड़तोड़ के नियंत्रित आंदोलन की आवश्यकता है (हेल्पर पिपेट प्रवेशनी की ओर बढ़ जबकि पोत लुमेन में प्रवेशनी चलता है) और व्यापक अभ्यास की आवश्यकता को एक उच्च सफलता दर प्राप्त होगा । सामान्य हैंक्स के लिए स्नान समाधान बदलें ‘ 2 मिमी सीए2 + (देखें तालिका 1) ३७ डिग्री सेल्सियस पर. आमतौर पर इस arteriole के एक मामूली संकुचन और प्रणा प्रवेशनी के चारों ओर एक तंग सील के गठन का कारण बनता है । इसके बाद हेल्पर पिपेट को पोत से दूर ले जाया जा सकता है । एक तंग मुहर 15 मिनट के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें एक यूएसबी कैमरा का उपयोग कर पोत देखें (और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर) माइक्रोस्कोप से जुड़ी और पोत सीमाओं और बाहरी और intraluminal रिक्त स्थान के बीच इसके विपरीत को अधिकतम करने के लिए ध्यान समायोजित करें (देखें चित्र b) । छवि ०.५ पर पोत-5 फ्रेंस/ 0 mmHg पर रिकॉर्डिंग के 1 मिनट के बाद, 3 तरह प्रणा प्रवेशनी से जुड़ी नल बंद करके वांछित स्तर पर intraluminal दबाव में वृद्धि ( चित्र 1bदेखें) और सिरिंज के माध्यम से प्रणाली को सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं । manometer पर दबाव परिवर्तन का निरीक्षण करें ।नोट: दबाव एक कदम बुद्धिमान फैशन में जोड़ा जा सकता है १०० mmHg या उदाहरण के लिए एक मूल्य के लिए ४० mmHg ( vivo मेंapproximating रेटिना arteriolar दबाव)23. पोत को तेजी से कंफर्म सफल cannulation का फैलाव करना चाहिए. कृपया ध्यान दें, दबाव प्रेरित वाहिकासंकीर्णन (यानी, myogenic प्रतिक्रिया) बाद में 15 मिनट की अवधि में विकसित होगा, लेकिन इन जहाजों के छोटे आकार की वजह से, यह हमेशा नेत्रहीन नहीं हो पाता है । ध्यान से स्पष्ट लीक के लिए प्रारंभिक प्रणा के दौरान पोत की निगरानी । रिसाव के स्रोतों से सट साइड शाखाओं या arteriole के अंदर करने के लिए प्रवेशनी की अपर्याप्त सील से उत्पंन हो सकता है । पोत छोड़ने intraluminal सामग्री के लिए देखो । छोटे, कम स्पष्ट लीक manometer पर दबाव में एक बूंद के रूप में समय के साथ स्पष्ट हो सकता है । यदि संभव हो तो, बंद करना अतिरिक्त टंगस्टन तार के साथ खोलने के लिए प्रवेशनी परेशान नहीं देखभाल ले फिसल जाता है । आगे विश्लेषण से स्पष्ट रिसाव के साथ तैयारी छोड़ें । पोत के लिए ब्याज abluminally की दवा लागू करने से पहले, या निंनलिखित, 15 मिनट प्रणा प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है (पूर्व myogenic टोन के विकास पर प्रभाव की अनुमति देता है निर्धारित किया जाना है, जबकि बाद प्रभाव का विश्लेषण सक्षम बनाता है स्थिर-राज्य myogenic टोन पर) । एक ठेठ दवा वितरण प्रणाली चित्रा 3ए में चित्र है । ब्याज की पोत के भाग के लिए सीधा वितरण आउटलेट स्थिति (के रूप में 1 डी चित्रामें सचित्र) एक दूरी पर ~ ५०० µm देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि आउटलेट इष्टतम है पूरी तरह से क्षेत्र superfuse angled के पोत से दूर (देखें चित्र बी) । सुनिश्चित करें कि छिड़काव में बदलाव शारीरिक रूप से पोत को परेशान न करें । एक प्रयोग के पूरा होने के बाद, 0Ca 2 का एक समाधान लागू+ हैंक्स ‘ युक्त 10 µ एम wortmannin (मायोसिन प्रकाश श्रृंखला कळेनासे अवरोध करनेवाला) करने के लिए अधिक से अधिक पोत को निष्क्रिय व्यास निर्धारित करने के लिए विस्तार ।नोट: cannulation सील की ताकत > 100 mmHg करने के लिए intraluminal दबाव स्थापना द्वारा प्रयोग के समापन पर परीक्षण किया जा सकता है । जहाजों के बहुमत भी इस उच्च एक तंग मुहर का संकेत दबाव में संलग्न रहेगा । arteriolar व्यास में परिवर्तन ट्रैक करने के लिए बढ़त का पता लगाने का उपयोग कर ऑफ़लाइन विश्लेषण निष्पादित (सुझाव दिया सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें). रक्त वाहिकाओं के बीच तुलना के लिए निष्क्रिय व्यास के लिए arteriole व्यास को सामान्य । 3. Ca2 + इमेजिंग नोट: पृथक रेटिना धमनियों पारंपरिक (microfluorimetry) और फोकल Ca2 + इमेजिंग के रूप में निम्नानुसार ( सामग्री की तालिकामें विस्तृत उपकरणों का उपयोग कर) के लिए तैयार कर रहे हैं. खंड 1 में वर्णित के रूप में एक 5 मिलीलीटर ग्लास टेस्ट ट्यूब में रेटिना homogenates तैयार करें । करने के लिए 1 मिलीलीटर की रेटिना homogenate जोड़ें फ्रा-2AM (microfluormetric ca2 + रिकॉर्डिंग) या Fluo-4AM (फोकल ca2 + इमेजिंग) 5 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए (प्रकाश से रक्षा); डाई संकेतक तरजीह चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में लोड । के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर बनाए रखने के 2 ज ट्यूब के पक्ष हर 15-20 मिनट फिर से रेटिना ऊतक निलंबित करने के लिए फ़्लिक । इसके बाद, LCH समाधान के साथ homogenate 1:4 पतला आगे डाई लदान को कम करने के लिए ।नोट: जहाजों के लिए 6 घंटे के लिए व्यवहार्य रहते है (जब 4 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में संग्रहीत); हालांकि यह सिफारिश की है कि प्रयोगों के रूप में जल्द ही शुरू कर रहे हैं आंतरिक organelles या समय पर डाई के बाहर निकालना में डाई के compartmentalization के प्रभाव को कम करने के लिए. एक गिलास तली हुई रिकॉर्डिंग चैंबर (आंशिक रूप से LCH से भरा) एक औंधा माइक्रोस्कोप एक Ca2 + microfluorimetry या फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली से जुड़े के मंच पर घुड़सवार करने के लिए रेटिना homogenate के 1-2 मिलीलीटर स्थानांतरण । रिकॉर्डिंग चैंबर भर में प्रवाह की दिशा के लिए सीधा लंगर धमनियों, टंगस्टन तार फिसल जाता है (५० µm व्यास, लंबाई में 2-4 मिमी) के साथ अंतरिक्ष ~ १००-२०० µm के अलावा पोत लंबाई के साथ ( चित्रा 3सी) एक ऐसी ही तकनीक का उपयोग कर वर्णित है कि चरण २.३ में । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सामान्य Ca2 + हैंक्स ‘ समाधान के साथ स्नान Perfuse । चित्रा 3 सी में चित्र के रूप में दवा वितरण आउटलेट की स्थिति और २.१७ कदम में वर्णित के रूप में जहाजों के लिए दवाओं को लागू. पारंपरिक Ca2 + इमेजिंग के लिए, एक तेल विसर्जन यूवी उद्देश्य के माध्यम से 340/380 एनएम प्रकाश के साथ पोत रोशन (जैसे, 100X, NA १.३) और एक फोटॉन गिनती photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) के माध्यम से ५१० एनएम पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति इकट्ठा । प्रत्येक प्रयोग के अंत में, एक MnCl-युक्त समाधान के साथ पोत शमन द्वारा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उपाय ( 1 तालिकादेखें) । विश्लेषण के लिए पृष्ठभूमि-सही प्रतिदीप्ति अनुपात (r-F340/प्रिंटर f380) का उपयोग करें या intracellular ca2 + ([ca2 +]मैं) rmin और rअधिकतम माप का उपयोग कर कनवर्ट करें (1 तालिका देखें; शमन करने से पहले लागू 24) और Grynkiewicz समीकरण25. के लिए फोकल Ca2 + इमेजिंग, ४८८ एनएम पर Fluo-4 भरी हुई जहाजों उत्तेजित और या तो लाइन स्कैन मोड (xt) या xyt स्कैन मोड में ४९०-५३५ एनएम पर परिणामी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पर कब्जा (५१२ x ५१२ पिक्सल; सुझाव दिया pinhole ३०० एनएम) । time t = एग्जिट (f/f0) पर रिकॉर्ड किए गए प्रतिदीप्ति में माप को सामांय करें । [Ca2 +में कोई भी परिवर्तन का आकलन करें]मैं दवा अनुप्रयोगों के दौरान या प्रणा ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों में ऑफ़लाइन (ROIs) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । यदि आवश्यक हो, तो Ca2 + इमेजिंग दबाव myography के साथ निष्पादित करें ।नोट: ऊपर के विवरण के लिए दबाव वाहिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है; हालांकि यह इस प्रकार के रूप में दबाव myography के साथ Ca2 + इमेजिंग गठबंधन करने के लिए संभव है । अनुभाग 1 के अनुसार धमनियों को अलग करना । Ca के साथ लोड2 + संकेतक ३.१-३.२ चरण के अनुसार रंजक । धमनियों को रिकॉर्डिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और धारा 2 के अनुसार cannulate । प्रकाश के लिए बढ़ते प्रक्रिया के दौरान जोखिम सीमा ध्यान रखना । माप Ca2 + चरण ३.५ या ३.७ के अनुसार ऊपर के रूप में । दबाव पोत और 2 Ca + की माप दोहराने। पोत व्यास के एक साथ माप Ca के मोड पर निर्भर है2 + माप और उपकरणों का इस्तेमाल किया.नोट: के लिए फोकल Ca2 + माप यह छवि के लिए आवश्यक हो सकता है अलग क्षेत्रों पूर्व और बाद में प्रकाश करने के लिए लंबे समय जोखिम के दौरान डाई के ब्लीचिंग के कारण प्रणा. 4. पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी नोट: पूरे सेल और एकल चैनल रिकॉर्डिंग अभी भी अपने माता पिता के भीतर धमनियों के रूप में एंबेडेड व्यक्तिगत arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं से संभव है ( सामग्री की तालिकामें विस्तृत उपकरणों का उपयोग करके) । अलग और एंकर रेटिना धमनियों रिकॉर्डिंग कक्ष में चरण 1, २.३, और ३.३ में वर्णित के रूप में । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, टंगस्टन तार फिसल जाता है २००-८०० µm के अलावा पोत के साथ दूरी पर हैं । बेसल लेमिना आसपास के arteriole और बिजली के कुछ आसंन चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और अंतर्निहित endothelial कोशिकाओं को हटाने से पहले पैच दबाना । ऐसा करने के लिए, आवश्यक अवधि के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम समाधान (तालिका 1) की एक अनुक्रमिक श्रृंखला के साथ पोत superfuse ।नोट: एंजाइम जोखिम की अवधि चूहे रेटिना धमनियों के लिए अनुकूलित है (को छेड़ो, ~ 8 मिनट, collagenase, ~ 12 मिनट) और दवा वितरण प्रणाली की प्रवाह की दर पर निर्भर करता है (~ 1 एमएल/हमारे सेट अप पर मिनट) और एंजाइमों के बैच के यूनिट गतिविधियों का इस्तेमाल किया जा रहा है । चित्रा 4में दिखाए गए के रूप में collagenase कदम के दौरान endothelial और चिकनी मांसपेशी परतों के दृश्य जुदाई पर पाचन के स्तर का मूल्यांकन करें । एक बार सेल परतों की जुदाई मनाया (जैसा चित्र 4Bमें दिखाया गया है), लागू DNAse मैं समाधान (~ 4 मिनट) तो सामांय Ca2 + ‘ हैंक्स समाधान के साथ स्नान समाधान के प्रतिस्थापन के द्वारा पाचन समाप्त । ध्यान पोत की सतह के साथ ठीक संदंश के बंद सुझावों को व्यापक द्वारा बेसल लेमिना और/या परिधीय neuropile के किसी भी शेष किस्में निकालें । खींचो और पॉलिश कांच केशिकाओं (सामग्री की तालिका), पिपेट समाधान (तालिका 1) के साथ भरें और सुरक्षित रूप से पैच-क्लैंप headstage के पिपेट धारक में जगह है । रिकॉर्डिंग चैंबर के संबंध में एक ४५ ° कोण पर पिपेट स्थिति और यह एक मोटर चालित micromanipulator पर मोटे सेटिंग का उपयोग पोत की ओर अग्रिम । एक चिकनी मांसपेशी पोत दीवार से फैला हुआ कक्ष का चयन करें और जिसकी सतह दिखाई मलबे से मुक्त है ( चित्रा 4Bदेखें) । स्थिति पैच की नोक पिपेट कार्यक्षेत्र के सेल पर खड़ी और कम धीरे से ठीक का उपयोग कर/micromanipulator के धीमी गति से आंदोलन चिकनी मांसपेशी झिल्ली के साथ संपर्क बनाने के लिए । सेल और सेल आंदोलन से नेत्रहीन पिपेट के बीच संपर्क का आकलन और पिपेट प्रतिरोध में परिवर्तन (सील) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में परीक्षण प्रोटोकॉल (0 mv, आवृत्ति 25 KHz से 5-10 mv नकारात्मक कदम) का उपयोग कर मापा जाता है . जब सील प्रतिरोध 5 गुना बढ़ गया है (जैसे, 2 से 10 MΩ बढ़ती; चित्र 5 ए (ii)) एक वाई-कनेक्टर, 3-रास्ता नल, सिरिंज और पिपेट धारक से जुड़ी टयूबिंग के माध्यम से पिपेट धारक के पीछे नकारात्मक दबाव क्षणिक लागू (धमनियों के प्रणा में इस्तेमाल किया है कि एक समान तरीके से इकट्ठे हुए, चित्र 1bदेखें). दोहराएं अनुप्रयोगों के नकारात्मक दबाव जब तक एक gigaseal (> 1 GΩ प्रतिरोध; के रूप में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में झिल्ली परीक्षण द्वारा संकेत) का गठन किया है (चित्रा 5 ए(iii)) । नोट, यह प्रक्रिया 1-5 min ले सकता है । यदि कोई gigaseal प्रपत्र में विफल रहता है, तो एक ताजा पैच पिपेट का उपयोग करके पैच क्लैंप के लिए कोई भिंन कक्ष चुनें । (आमतौर पर 0,-४० या-८० एमवी) प्रदर्शन किया जा रहा प्रयोग के अनुसार अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के माध्यम से सेल के लिए एक होल्डिंग क्षमता लागू करें । वर्तमान विन्यास में अध्ययन (ऑन-सेल) एकल चैनल गतिविधि. वैकल्पिक रूप से, gigaseal गठन के बाद तेजी से सेल सतह से पैच पिपेट वापस लेने के द्वारा अंदर बाहर पैच उत्पन्न करते हैं । झिल्ली के मुक्त समाप्त होता है के रूप में फिर से इन शर्तों के तहत ऐनी जोड़ तोड़ (मोटे सेटिंग) के तेजी से ऊर्ध्वाधर आंदोलन के माध्यम से स्नान से पिपेट को दूर कर सकते हैं । तेजी से meniscus के माध्यम से वापस पिपेट टिप के अंदर ही पैच छोड़ने के लिए सुधार झिल्ली को दूर करने के लिए । 5 KHz करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर नमूना आवृत्ति सेट और चैनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए निरंतर रिकॉर्डिंग मोड सक्रिय करें. सॉफ्टवेयर या एम्पलीफायर के माध्यम से आवश्यक हो तो किसी भी वोल्टेज परिवर्तन लागू करें. यदि आवश्यक हो, तो चरण २.१७ में बताए गए अनुसार औषधियों को पोत/ यदि झिल्ली खिंचाव की आवश्यकता है, एक 3 तरह से नल और वाई-संबंधक के माध्यम से एक manometer से जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर पिपेट के पीछे नकारात्मक दबाव लागू होते हैं । मानक प्रक्रियाओं के अनुसार ओपन संभाव्यता और यूनिटी कंडक्टर के लिए एकल चैनल रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करें26. सामग्री की तालिकाके अनुसार पूरे सेल वर्तमान रिकॉर्डिंग खींचने और पॉलिश पिपेट के लिए, amphotericin बी युक्त पिपेट समाधान के साथ भरें (µ के ५० DMSO एल के लिए amphotericin बी के 3 मिलीग्राम जोड़ें; जोड़ें 3-6 µ पूरे सेल पिपेट समाधान के 1 मिलीलीटर के लिए इस के एल, sonicate मिश्रण करने के लिए) और चरण ४.६-४.९ के अनुसार एक मुहर के रूप में । amphotericin बी के शामिल होने के कारण पिपेट टिप के भीतर झिल्ली टूटना करने के लिए पूरे सेल का उपयोग हासिल करने की कोई जरूरत नहीं है । मॉनिटर का उपयोग, जो धीरे से प्राप्त किया जाएगा, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में झिल्ली परीक्षण प्रोटोकॉल का उपयोग (-20 एमवी कदम से-४० एमवी, नमूना आवृत्ति 25 KHz; चित्रा 5Bदेखें). कुछ सॉफ्टवेयर में क्षमता यात्रियों की स्वचालित फिटिंग का उपयोग प्रतिरोध और कोशिका समाई के वास्तविक समय माप (वैकल्पिक रूप से यात्रियों के सापेक्ष गिरावट आई द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है) । एक बार उपयोग प्रतिरोध < 15 MΩ करने के लिए, पूरे सेल पैरामीटर डायल (समाई और श्रृंखला प्रतिरोध) एम्पलीफायर पर का उपयोग कर श्रृंखला प्रतिरोध मलता (चित्रा 5C) प्रदर्शन करते हैं । ऐसा करने के लिए, स्वचालित फिटिंग मान का उपयोग करने के लिए शुरू में डायल सेट ( चित्रा 5C(द्वितीय) देखें) तो श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा डायल वृद्धि (दोनों भविष्यवाणी और सुधार एम्पलीफायर पर उपलब्ध है) फिर से समायोजन पूरे सेल को मलता है जबकि समाई क्षणिक को कम करने ( चित्रा 5C(iii) देखें) । देखभाल नहीं करने पर क्षतिपूर्ति करने के लिए (जैसा चित्र 5C(iv) में दिखाया गया) । आमतौर पर, यह छिद्रित पैच मोड में ७५% द्वारा श्रृंखला प्रतिरोध क्षतिपूर्ति करने के लिए संभव है (अधिकतम पर सेट किया जा करने के लिए अंतराल क्षतिपूर्ति की आवश्यकता है). यदि कोई स्वचालित फिटिंग उपलब्ध नहीं है, तो पूरे-सेल पैरामीटर्स को सेट करके प्रारंभ करें 15 पीएफ और 15 mΩ (इन कक्षों के लिए विशिष्ट मान) पर डायल करता है और फिर आरेख 5C(ii) में दिखाए गए आउटपुट को समायोजित करने के लिए समायोजन करता है । श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा बढ़ाएँ ~ ७५% करने के लिए डायल और चित्रा 5C(iii) के अनुसार पूरे सेल मापदंडों डायल को समायोजित. प्रयोग शुरू करने से पहले नोट सेल समाई माप या तो प्रारंभिक स्वचालित फिटिंग से या मैनुअल मुआवजे के बाद डायल से ।नोट: यह मान कक्ष आकार करने के लिए धाराओं को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है । श्रृंखला प्रतिरोध के लिए मुआवजा प्रयोग के दौरान समायोजित करने के लिए उपयोग के रूप में पैच में amphotericin बी के आगे निगमन के कारण सुधार जारी रख सकते है की आवश्यकता हो सकती है । २.१७ कदम में वर्णित के रूप में जहाजों के लिए दवाओं को लागू करें । प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार वोल्टेज प्रोटोकॉल (या तो कदम या रैंप) लागू करें ।नोट: ठेठ वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल, ०.१-1 अवधि में एस, 10-20 एमवी वेतन वृद्धि में धारण क्षमता से लागू कर रहे है हर 5-10 के लिए वोल्टेज के एक परिवार के उत्पादन धाराओं सक्रिय । वैकल्पिक रूप से एक ‘ झाडू ‘ में वोल्टेज की एक श्रृंखला पर धाराओं को मापने के लिए रैंप प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए धीमी गति से धीरे रैंप (१००-२०० एमवी /-८० से + ८० एमवी (हर 5-10 एस लागू) रैंप के दौरान 10 एमवी अंतराल पर वर्तमान के ऑफ़लाइन नमूने के साथ । इस प्रकार के रूप में पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के साथ Ca2 + इमेजिंग गठबंधन करने के लिए संभव है । अनुभाग 1 के अनुसार धमनियों को अलग करना । Ca के साथ लोड2 + संकेतक रंगों के अनुसार ३.१-३.२ । धारा 4 के अनुसार रिकॉर्डिंग चैंबर में माउंट । ध्यान रखना इन प्रक्रियाओं के दौरान प्रकाश के लिए जोखिम सीमा ।नोट: तिथि करने के लिए यह पैच-दबाव myography एंजाइमी पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान तहखाने झिल्ली और पोत अखंडता के नुकसान के कारण अध्ययन के साथ दबाना गठबंधन करने के लिए संभव नहीं किया गया है
Representative Results
चित्रा 6A चूहे रेटिना संवहनी पेड़ के एक योजनाबद्ध ड्राइंग से पता चलता है । व्यास पर्वतमाला के पहले आदेश (30-45 µm), दूसरा आदेश (20-30 µm), और पूर्व केशिका धमनियों (8-20 µm) की पुष्टि की गई है हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग द्वारा चूहे रेटिना की पूरी-माउंट तैयारियों के फोकल इमेजिंग immunohistochemically बला त्यात α-चिकनी बलवान actin (फिगर घमण्ड). रेटिना, प्राथमिक, माध्यमिक और पूर्व केशिका धमनियों के पृथक्करण पर उनकी क्षमता और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की व्यवस्था के आधार पर पहचाना जा सकता है । पहले और दूसरे क्रम धमनियों उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत नेत्रहीन समान दिखाई देते हैं, लेकिन उनके आकार (चित्रा 6C) के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है । पूर्व केशिका धमनियों तैयारी में सबसे छोटी धमनी वाहिकाओं हैं और संवहनी चिकनी मांसपेशी फाइबर के अपने sparser व्यवस्था के कारण आसानी से पहचानने योग्य हैं । अलग धमनियों स्पष्ट रूप से केशिकाओं और अलगाव के भीतर venules से विभेदित किया जा सकता है । केशिकाओं छोटे कैलिबर (व्यास में 4-10 µm) वाहिकाओं के एक meshwork के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि venules पतली दीवारों और कमी चिकनी मांसपेशी सेल कवरेज (चित्रा 6C) हैं । प्राथमिक, माध्यमिक और पूर्व केशिका धमनियों दबाव myography, Ca2 + इमेजिंग और पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । चित्रा 7 एक दबाव myography प्रयोग से पता चलता है जहां एक प्राथमिक चूहा रेटिना arteriole गया है cannulated और intraluminal ४० mmHg को उठाया दबाव । arteriole तो इस दबाव पर बनाए रखा है myogenic टोन के विकास के लिए अनुमति देने से पहले 0Ca 2 के अलावा+ हैंक्स ‘ युक्त 10 µ एम wortmannin पोत के निष्क्रिय व्यास प्राप्त करने के लिए । चित्रा 7A प्रयोग के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर arteriole के photomicrographs से पता चलता है । समय के साथ पोत व्यास में परिवर्तन दिखा एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम रिकॉर्ड कस्टम मेड एज-डिटेक्शन सॉफ्टवेयर27का उपयोग चित्रा 7B में रची गई है । प्रणा पर तुरंत पोत फैली हुई है, जो फिर एक सक्रिय myogenic कसना है कि 15 मिनट के बाद एक स्थिर राज्य स्तर तक पहुंच के बाद है । 0Ca के अलावा2 + हैंक्स ‘/wortmannin समाधान पोत एक के समान स्तर पर वापस फैली हुई है कि तुरंत प्रारंभिक दबाव कदम के बाद मनाया । जैसा कि ऊपर वर्णित है, दवाओं के जहाजों के लिए लागू किया जा सकता है पहले या निंनलिखित प्रणा के विकास और इन जहाजों में myogenic टोन के रखरखाव अंतर्निहित तंत्र की जांच । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले से पता चला है कि खिंचाव सक्रिय क्षणिक रिसेप्टर संभावित Vanilloid 2 (TRPV2) चैनलों और एल और टी-प्रकार वोल्टेज-gated Ca2 + चैनलों में myogenic टोन विकास को सुविधाजनक बनाने में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं पहली और दूसरा आदेश चूहा रेटिना धमनियों20,21,22। हम यह भी सूचित किया है कि बड़े-कंडक्टर Ca2 + सक्रिय पोटेशियम चैनल (बीके चैनल)19,28 और kv1-युक्त वोल्टेज-gated k+ चैनल में myogenic गतिविधि का विरोध करने के लिए कार्य इन जहाजों, इन चैनलों में से प्रत्येक के लिए विशिष्ट अवरोधकों के अलावा के बाद से वाहिकासंकीर्णन (चित्रा 7C) ट्रिगर । चित्रा 8 के उदाहरण से पता चलता है पारंपरिक और फोकल Ca2 + रेटिना धमनियों में इमेजिंग करने से पहले और vasoconstrictor पेप्टाइड के लिए प्रदर्शन के बाद, endothelin-1 (एट-1). पारंपरिक फ्रा-2-आधारित रिकॉर्डिंग (चित्रा 8A), एट-1 (10 एनएम) में एक biphasic वृद्धि में शामिल है [Ca2 +]मैं रेटिना arteriolar चिकनी मांसपेशी परत में, एक प्रारंभिक क्षणिक घटक के एक कम निरंतर द्वारा पीछा घटक. हम पहले के रूप में क्षणिक और निरंतर घटकों की विशेषता है ca2 + रिलीज से endoplasmic जालिका और ca2 + extracellular अंतरिक्ष से आमद, क्रमशः29। Fluo-4-आधारित फोकल Ca2 + इमेजिंग सेलुलर स्तर पर एट-1 के प्रभाव का एक अधिक विस्तृत चित्र प्रदान करता है । इन प्रयोगों में यह स्पष्ट है कि वैश्विक [ca2 +] में चिकनी वर्गीकृत परिवर्तनमैं एट से हमारे microfluorimetry अध्ययन परिणाम में मनाया-1 दोहराए अतुल्यकालिक के सक्रियकरण उत्तेजक [ca2 +]मैं पड़ोसी रेटिना arteriolar में दोलन पोत दीवार के साथ चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (चित्रा 8B, सी; 30). चित्रा 9 रेटिना arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं से एकल चैनल और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के उदाहरण से पता चलता है. तारीख करने के लिए, हम दोनों पर सेल और अंदर बाहर एक चैनल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग22,28बाहर किया जाता है । चित्रा 9A, बी उदाहरण के लिए, एक ऑन-सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग करने से पहले और झिल्ली खिंचाव के बाद (पैच पिपेट के लिए नकारात्मक दबाव लागू करने से उत्पन्न) दिखाएँ. इस विशेष पैच यांत्रिक खिंचाव से सक्रिय कर रहे हैं, जो दो चैनलों में शामिल हैं । हम पहले से दिखा दिया है कि इन धाराओं TRPV2 चैनल ताकना-22एंटीबॉडी अवरुद्ध का उपयोग कर बाधित किया जा सकता है । चैनलों के एकात्मक कंडक्टर (२४९.७१ pS) भी इन धाराओं के अनुरूप है31TRPV2 द्वारा मध्यस्थता की जा रही है । पूरे सेल वोल्टेज-सक्रिय धाराओं वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर पैदा किया जा सकता है । चित्रा 9C वोल्टेज के एक परिवार से पता चलता है सक्रिय एक प्रकार K+ धाराओं इस तरह के एक दृष्टिकोण का उपयोग दर्ज की गई. इन धाराओं जब इन कोशिकाओं में मौजूद अन्य बड़े धाराओं (जैसे, बीके और सीए+-सक्रिय सीएल- धाराओं) विशिष्ट औषधीय एजेंटों३२,३३का उपयोग कर अवरुद्ध कर रहे हैं स्पष्ट हो जाते हैं । गैर के माध्यम से धाराओं या कमजोर वोल्टेज पर निर्भर आयन चैनल आम तौर पर वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल का उपयोग कर जांच कर रहे हैं । हम पहचान और रेटिना arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में hypotonic खिंचाव22 और चैनल एगोनिस्ट (चित्रा 9D) द्वारा सक्रिय TRPV2 धाराओं की विशेषता के लिए इस तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग किया है. चित्रा 10 दोहरी दबाव myography और फोकल Ca2 + इमेजिंग एक प्राथमिक चूहा रेटिना arteriole में लागू दिखाता है । प्रणा ट्रिगर वृद्धि की आवृत्ति [Ca2 +]मैं व्यक्तिगत चिकनी मांसपेशी उन के समान कोशिकाओं में दोलनों एट के साथ मनाया-1 । हम पहले से दिखाया गया है कि इन दोलनों ca2 + स्पार्क्स के योग से ट्रिगर कर रहे हैं (स्थानीय Ca2 + रिलीज़ घटनाओं) और myogenic टोन20की पीढ़ी के लिए योगदान. चित्रा 1 . चूहे रेटिना धमनियों में दबाव myography के लिए प्रयोगात्मक सेटअप । A) उल्टे माइक्रोस्कोप सहित प्रयोगात्मक उपकरण, स्नान perfusate के लिए लाइन हीटर, 3-अक्ष यांत्रिक और माइक्रो-हेर-फेर, manometer, प्रवेशनी धारक और एयर टेबल । ख) योजनाबद्ध चित्र रिकॉर्डिंग चैंबर में cannulating पिपेट और ब्याज की पोत की इष्टतम व्यवस्था दिखा । यह आरेख भी प्रणा उपकरण के मूल सेट-अप को दिखाता है । ग) योजनाबद्ध चित्र एंकरिंग की प्रक्रिया को दिखाया और अतिरिक्त टंगस्टन तार का उपयोग पोत चलती ठीक संदंश में आयोजित फिसल जाता है । (i) बंद करना पोत को 1st स्लिप ड्रॉप करें । (ii, iii) अतिरिक्त पर्ची का प्रयोग करें occluding पर्ची (तीर द्वारा संकेत दिया दिशा) और इष्टतम (iv) में दिखाया अभिविंयास में पोत के साथ कुहनी से ऊपर नज । घ) योजनाबद्ध आरेख occluding टंगस्टन वायर स्लिप की इष्टतम स्थिति दिखा, हेल्पर पिपेट और प्रवेशनी के रूप में पोत के संबंध में cannulation से पहले की व्यवस्था की । दवा वितरण प्रणाली के आउटलेट दवा आवेदन के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए पोत से ~ ५०० µm की दूरी पर तैनात है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 2 . दाब myography के लिए Cannulation प्रक्रिया । क) एक रेटिना दिखा Photomicrographs रिकॉर्डिंग चैंबर में नीचे लंगर arteriole (i) के दौरान, (ii)-(v) और निंनलिखित cannulation (vi) । नीले तीर प्रवेशनी के आंदोलन की दिशा इंगित करता है, जबकि हरी तीर हेल्पर पिपेट के आंदोलन की दिशा को इंगित करता है । ख) Photomicrograph के दौरान myogenic गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए इष्टतम क्षेत्र दिखा रहा है प्रणा के रूप में लाल रंग में प्रकाश डाला । नोट, प्रकाश और ध्यान का समायोजन पोत दीवारों के विपरीत बढ़ाने के लिए स्वचालित विश्लेषण के लिए जहाजों के किनारों की बेहतर ट्रैकिंग सक्षम बनाता है । स्केल बार इंगित करता है ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 3 . दवा वितरण । क) एक मल्टी चैनल प्रसव कई गुना से जुड़े समाधान जलाशयों दिखा दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों 3-तरह से नल द्वारा नियंत्रित और एक 3-अक्ष यांत्रिक जोड़तोड़ से जुड़ी । ख) रिकॉर्डिंग चैंबर के संबंध में दवा वितरण कई गुना की इष्टतम ऊर्ध्वाधर स्थिति दिखा आरेख । ग) एक पोत के Photomicrograph रिकॉर्डिंग कक्ष में नीचे लंगर दवा वितरण आउटलेट के आदर्श स्थिति दिखा । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्र 4 . पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए रेटिना धमनियों के एंजाइमी पाचन। (a) और उसके बाद (B) एंजाइमी पाचन से पहले एक रेटिना arteriole की हल्की माइक्रोग्राफ. भौतिक पृथक्करण (तीरों द्वारा दर्शाया गया) चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs) के अंतर्निहित endothelial कक्षों (ईसीएस) से नोट करें । पैच clamping के लिए उपयुक्त चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को एक तारे के साथ संकेत कर रहे हैं । स्केल बार 10 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । चित्रा 5 . एकल चैनल और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग । A) परीक्षण धाराओं के चित्रण ‘ सील ‘ परीक्षण प्रोटोकॉल के दौरान मनाया जब: (i) पैच पिपेट बाहरी स्नान माध्यम में प्रवेश करती है, (ii) पिपेट टिप संवहनी चिकनी मांसपेशी सेल प्लाज्मा झिल्ली के साथ संपर्क में आता है और (iii) चूषण है gigaseal गठन को सक्षम करने के लिए पिपेट की पीठ पर लागू । पैच दबाना एम्पलीफायर का उपयोग पिपेट समाई मुआवजा के बाद, एकल चैनल धाराओं अब सेल विन्यास में दर्ज किया जा सकता है या झिल्ली का एक पैच तेजी से पिपेट एक ‘ अंदर से बाहर ‘ पैच बनाने के लिए वापस लेने के द्वारा किया जा सकता है. ख) वर्तमान amphotericin बी पूरे सेल छिद्रित पैच दबाना तकनीक के आवेदन के दौरान सेल इंटीरियर के लिए बिजली का उपयोग के विकास के साथ जुड़े परिवर्तन (i): (ii) झिल्ली में amphotericin बी विभाजन के रूप में, का उपयोग प्रतिरोध गिरता है और समाई यात्रियों hyperpolarizing वोल्टेज कदम के दौरान (से-४० के लिए-६० mV) बड़ा हो गया; (iii) एक बार उपयोग प्रतिरोध (Ra) < 15 MΩ पर गिर गया है, जो आमतौर पर gigaseal गठन के बाद 5-10 मिनट लेता है, प्रयोग संभव है । ग) से पहले पूरे सेल रिकॉर्डिंग, उपयोग प्रतिरोध और कोशिका समाई पैच क्लैंप एम्पलीफायर पर प्रासंगिक डायल का उपयोग कर मुआवजा दिया जाना चाहिए. उपयोग प्रतिरोध और सेल समाई पैच के भीतर स्वचालित कार्यों द्वारा प्रदान की मान-क्लैंप सॉफ्टवेयर इस प्रक्रिया गाइड में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: (i) बी (iii) में प्रकाश डाला क्षेत्र से लिया मुआवजा करने से पहले समाई क्षणिक से पता चलता है; (ii) का उपयोग प्रतिरोध और समाई क्षतिपूर्ति कर रहे हैं जब सामान्य रूप से देखा समाई क्षणिक में कमी को दर्शाता है; (iii) श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा तो ७५% तक सही किया जाना चाहिए और उपयोग प्रतिरोध और समाई मलता है ठीक-देखते है कि जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक के ऊपर और नीचे वर्तमान के पठार के स्तर के नीचे आयाम में अपेक्षाकृत बराबर होना चाहिए कदम । (iv) देखभाल सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि उपयोग प्रतिरोध पर क्षतिपूर्ति नहीं है (क्षण की ‘ बज ‘ की उपस्थिति के द्वारा संकेत), जो कभी भी हो सकता है अगर उपयोग के दौरान प्रयोग के दौरान सुधार जारी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 6 . पृथक चूहे रेटिना धमनियों की पहचान. एक) चूहा रेटिना microvascular पेड़ की व्यवस्था दिखा चित्रण । ख) चूहा रेटिना धमनियों और फ्लैट माउंट तैयारी के भीतर venules के फोकल छवियों αSMA के लिए सना हुआ (लाल; नाभिक नीले दाग हैं; स्केल पट्टियां ५० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं) । ग) पृथक की हल्की माइक्रोग्राफ 1 °, 2 ° और पूर्व केशिका धमनियों, एक केशिका नेटवर्क और venule (स्केल बार्स 10 µm का प्रतिनिधित्व करते हैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 7 . Arteriolar दबाव myography रिकॉर्डिंग। क) एक cannulated रेटिना दिखा arteriole की छवियां (i) विश्राम व्यास (लगभग ३५.६ µm), (ii) प्रणा पर फैलाव, (iii) myogenic वाहिकासंकीर्णन के विकास और (iv) फैलाव के कारण 10 µ m wortmannin के अलावा 0Ca में2 + हैंक्स ‘ समाधान । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 10 µm. B) एक में दिखाए गए पूर्ण प्रयोग के लिए पोत व्यास के समय पाठ्यक्रम भूखंड (२.५ फ्रेम पर नमूना/ ग) व्यास स्थिर राज्य myogenic टोन (व्यास ३८.७ µm) के तहत एक अलग arteriole से ट्रेस Kv1 चैनल अवरोधक correolide (10 µ मीटर) और बीके चैनल अवरोध करनेवाला iberiotoxin (१०० एनएम) के प्रभाव दिखा (०.५ फ्रेम में नमूना/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 8 . एट-1 पर प्रभाव [Ca2 +] मैं चूहा रेटिना धमनियों में गतिविधि संकेतन। A) पारंपरिक फ्रा-2-आधारित रिकॉर्डिंग एट-1 (10nM) पर वैश्विक [Ca2 +]iके प्रभाव दिखा । बेसल [सीए2 +]मैं इस 1 ° arteriole में ८२ एनएम था । ख) Fluo-4 आधारित फोकल xt छवियों पर एट-1 के प्रभाव को दिखा [Ca2 +]मैं सेलुलर स्तर पर । C) सामान्य प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्लाट (f/f0) कक्षों में मापी गई यथा चिह्नित बी. यह आंकड़ा Tumelty एट अल से संशोधित किया गया है । 30 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 9 . एकल चैनल और पूरे सेल पैच-चूहा रेटिना arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं से दबाना रिकॉर्डिंग। a, b) एक ही झिल्ली पैच से सेल एकल चैनल रिकॉर्डिंग से पहले (A) और के दौरान (b) नकारात्मक दबाव के आवेदन (-४५ mmHg) पैच पिपेट करने के लिए. दो चैनल पैच में मौजूद हैं (एकात्मक वर्तमान १२.८१ pA; यूनिटी कंडक्टर २४९.७१ pS) जो सक्रियण में खिंचाव की स्थिति में पर्याप्त वृद्धि दिखाते हैं. ऊपरी पैनलों (i) से चयनित क्षेत्रों कम पैनलों (द्वितीय) में एक तेज समय आधार पर दिखाए जाते हैं । ग) एक-प्रकार के कश्मीर के परिवार+ चैनल धाराओं (मैं) बीके और सीए 2 के अवरोधकों की उपस्थिति में पूरे सेल मोड में दर्ज+-सक्रिय सीएल चैनल अवरोधकों, के बीच 20 एमवी वोल्टेज कदम वेतन वृद्धि के जवाब में जुटाया-८० एमवी करने के लिए + ८० एमवी (द्वितीय) । घ) पूरे सेल धाराओं (i) वोल्टेज रैंप के बीच से (काली लाइन) और (रेड लाइन) TRPV2 चैनल एगोनिस्ट डेल्टा-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) के दौरान से पहले ८० एमवी और + ८० एमवी से अधिक है । वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया निचले पैनल में दिखाया गया है (द्वितीय). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 10 . Ca2 + फोकल इमेजिंग करने से पहले और एक चूहे रेटिना arteriole के बाद प्रणा । प्रतिनिधि फोकल xt स्कैन (मैं) के तहत रेटिना arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एक) और (ख) दबाव की स्थिति एक ही पोत के अलग क्षेत्रों से प्राप्त की । (ii) व्यक्तिगत कक्षों a-e में दर्ज किए गए सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति (f/f0) में परिवर्तन, जैसा कि (i) में दर्शाया गया है, समय के विरुद्ध प्लॉट किया गया है । तारक व्यक्तिगत उपसेलुलर सीए2 + स्पार्क्स जो प्रणा और summate के बाद आवृत्ति में वृद्धि सेलुलर सीए2 + दोलनों को ट्रिगर करने के लिए संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । यौगिक (मिमी) कम Ca2 + हैंक्स ‘ 0Ca2 + हैंक्स ‘ नॉर्मल हैंक्स ‘ अलगाव एंजाइम को छेड़ो अलगाव एंजाइम Collagenase अलगाव एंजाइम DNAse शमन समाधान Rmin समाधान Rmax समाधान सेल संलग्न Extracellular समाधान सेल संलग्न पिपेट समाधान पूरे सेल extracellular समाधान पूरे सेल पिपेट समाधान जल शुद्धता (प्रतिरोध) ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 18 MΩ. से. मी ≥ 15 MΩ. से. मी ≥ 18 MΩ. से. मी Nacl १४० १४० १४० १४० १४० १४० १४० १४० १४० १४० kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 १३८ D-ग्लूकोज 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 MgCl२ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ १.३ 1 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 CaCl२ ०.१ 2 ०.१ ०.१ ०.१ 10 2 2 2 ०.२ EGTA 4 ०.५ MnCl 10 Ionomycin ०.०१ Koh १४० १३० डी-Gluconic एसिड १३० १३० Naoh 10 Penitrem एक ०.०००१ ०.०००१ ०.०००१ 4-aminopyridine 10 Nimodipine ०.०१ ०.०१ Fluoxetine ०.१ 9-anthracenecarboxylic एसिड 1 Amphotericin बी 300-600 μg एमएल-1 टीज़ प्रकार XIV ~ ०.०१% (0.4-0.6 mg/ Collagenase टाइप 1a ०.१% (6 mg/ DNAse I 20 कू (20 μL 1 MU/एमएल स्टॉक 20 एमएल में) फोन ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.४ ७.२ साथ titrated Naoh Naoh Naoh Naoh Naoh Naoh Naoh Naoh Naoh Tris Tris Naoh Koh तालिका 1. प्रयोग में प्रयुक्त समाधानों की संरचना जिसमें एकल चैनल (TRPV2) और पूरे सेल (A-Type) धाराओं के लिए प्रयुक्त बाहरी और पिपेट समाधानों के उदाहरण शामिलहैं ।
Discussion
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल अभ्यास की आवश्यकता होती है, लेकिन ंयूनतम समस्या निवारण के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए । एक औसत दिन हम अलगाव से 6-8 प्रयोग करने योग्य धमनियों प्राप्त होगा और 3-4 सफल प्रयोगों को प्राप्त करने पर । समस्याओं का सामना कर रहे हैं, हालांकि, कुछ कदम है कि सफलता दरों में सुधार करने में मदद करने के लिए लिया जा सकता है । कभी कभार हमने पाया है, विशेष रूप से जब छोटे चूहों का उपयोग कर (< 8 सप्ताह), कि धमनियों की उपज कम हो सकती है । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम रेटिना ऊतक (५०० x g पर 10-30 s) चरणों १.१२-१.१४ में trituration चरणों में से प्रत्येक के बीच केंद्रापसारक सुझाव है । यह अक्सर जहाजों की उपज में सुधार करने में मदद करता है, लेकिन यह भी तैयारी के भीतर सेल मलबे की मात्रा में वृद्धि होगी ।
जब दबाव myography अध्ययन के लिए cannulating वाहिकाओं यह विभाजन साइट के करीब सट गया हो सकता है कि किसी भी पक्ष-शाखाओं के लिए ध्यान से धमनियों की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह रिसाव और प्रयोग के दौरान दबाव के नुकसान का एक आम कारण का प्रतिनिधित्व करता है । मुख्य मुद्दा है कि [2 Ca +]मैं प्रोटोकॉल के साथ पैदा कर सकते है डाई लदान के स्तर पर है । गरीब डाई लोडिंग कम संकेत करने वाली शोर अनुपात करने के लिए सुराग, जबकि सामान्य सीए2 + homeostasis के विघटन में परिणाम ओवरलोडिंग. इन समस्याओं में से या तो की संभावना को कम करने के लिए, रेटिना homogenate का एक छोटा aliquot निकाला जा सकता है, और अलग-थलग जहाजों लोड प्रोटोकॉल के दौरान आवधिक जाँच की । पैच दबाना प्रयोग जब उपक्रम, gigaseal गठन की सफलता की दर कितनी अच्छी तरह बेसल लेमिना पच गया है पर निर्भर है । जब शुरू में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण या एंजाइमों की नई बहुत सारी का उपयोग कर यह एकाग्रता को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है/ ध्यान से endothelial और चिकनी मांसपेशी परतों की जुदाई की निगरानी पर्याप्त पाचन को दूर करने के लिए काफी बेसल laminal का उपयोग प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करेगा । सावधान निगरानी भी अधिक से बचने के लिए आवश्यक है-पाचन, जो प्रकट कर सकते है के रूप में पोत कसना शुरू होता है । यदि ऐसा होता है, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं अक्सर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए भी नाजुक हैं । जब एंजाइमों आवेदन, यह DNAse मैं आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से मुक्त डीएनए की किस्में को हटाने को सुनिश्चित करने के लिए शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. डीएनए टुकड़े चिपचिपा रहे है और संदंश कारण सफाई की प्रक्रिया (४.४ कदम), अक्सर पोत हानि में जिसके परिणामस्वरूप के अंतिम चरणों के दौरान arteriole का पालन करें । जहाजों की सफाई तकनीकी रूप से मुश्किल है और सबसे अच्छा संभव टिप व्यास के बंद संदंश के कोमल व्यापक गति के साथ उच्च आवर्धन (20X) पर प्रदर्शन किया है । राज्यभर के बीच, लैब रोल के साथ संदंश साफ ।
के रूप में पहले प्रकाश डाला, इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रोटोकॉल के विकास के पीछे एक महत्वपूर्ण प्रेरणा को बेहतर क्यों रक्त प्रवाह रेटिना संवहनी रोगों के दौरान बाधित है समझ गया था । तिथि करने के लिए हमारे काम के अधिकांश मधुमेह नेत्र रोग28,३३पर ध्यान केंद्रित किया है । धमनियों खंड 1 में वर्णित विधियों का उपयोग कर मधुमेह के प्रायोगिक कुतर मॉडलों के रेटिना से अलग किया जा सकता है । जब मधुमेह जानवरों से अलग रेटिना धमनियों पर प्रयोग, यह बारीकी से vivo मेंजहाजों द्वारा अनुभवी hyperglycemic स्थितियों को दोहराने की कोशिश करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस कारण से, हम आम तौर पर डी-ग्लूकोज का स्तर बढ़ाने के लिए होगा हमारे अलगाव और प्रायोगिक समाधान में 25 मिमी. संवहनी तहखाने झिल्ली की और अधिक मोटा होना मधुमेह३४,३५के दौरान रेटिना वाहिकाओं में एक अच्छी तरह से पहचाना घटना है । लंबे समय तक मधुमेह के साथ जानवरों का उपयोग करते समय (> 1 महीने की बीमारी की अवधि), बढ़ी हुई एंजाइम सांद्रता या पाचन बार अक्सर पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग तरीकों के आवेदन को सक्षम करने के लिए की जरूरत है ।
रेटिना संवहनी फिजियोलॉजी और pathophysiology का अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo पृथक रेटिना धमनियों का उपयोग करने की एक महत्वपूर्ण सीमा आसपास के रेटिना neuropile का नुकसान है. हालांकि रेटिना glial और न्यूरॉन कोशिकाओं को हटाने के सेल फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए रेटिना संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के लिए आसान पहुँच सक्षम बनाता है, vasoactive मध्यस्थों के लिए जहाजों की प्रतिक्रिया रेटिना की अनुपस्थिति और उपस्थिति में नाटकीय रूप से बदल सकते हैं ऊतक. adenosine त्रिकोणीय फॉस्फेट (एटीपी) के कार्यों, उदाहरण के लिए, इस बिंदु का एक अच्छा चित्रण प्रदान करते हैं । अलग चूहे रेटिना धमनियों में, एटीपी के अलावा३६जहाजों की एक मजबूत कसना चलाता है, जबकि एक बरकरार neuropile की उपस्थिति में, जहाजों३७का फैलाव । इसलिए, जहां भी संभव हो, हम आमतौर पर हमारे पृथक arteriole पूर्व विवो रेटिना पूरे का उपयोग कर तैयारियों से महत्वपूर्ण निष्कर्षों को मान्य करने की कोशिश-माउंट और vivo माप में पोत व्यास और रक्त प्रवाह16,३७ . ध्यान दें की, नए तरीके हाल ही में छोटे धमनियों और केशिकाओं पूरे perfused सुअर का में अध्ययन के लिए उभरा है रेटिना ex३८,३९। इस तरह की तैयारी बहुत रेटिना neuropile रेटिना arteriolar और केशिका टोन कैसे नियंत्रित करता है की हमारी समझ में सुधार करने के लिए की संभावना है और रेटिना में ंयूरॉन गतिविधि कैसे haemodynamics में परिवर्तन मॉडुलन ।
हालांकि इस पत्र में वर्णित प्रक्रियाओं arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए अलग चूहे रेटिना धमनियों के उपयोग पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, हम वर्तमान में भी endothelial सेल समारोह के अध्ययन को सक्षम करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं इन जहाजों । प्रारंभिक काम में, हम रेटिना arteriolar क्षेत्रों के एंजाइमी पाचन को संशोधित करने के लिए व्यवहार्य endothelial सेल ट्यूबों कि सीए 2 के लिए उत्तरदायी है उपज+ इमेजिंग और patchclamp रिकॉर्डिंग अध्ययन में सफल रहे हैं । दोनों सिरों पर पृथक धमनियों की Cannulation, दवाओं के intraluminal वितरण को सक्षम करने, भविष्य में भी endothelium-निर्भर vasodilatory प्रतिक्रियाओं को सक्षम करने के लिए इन जहाजों में जांच की जा सकती है ।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल का विकास निम्नलिखित धन एजेंसियों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: BBSRC (BB/I026359/1), दृष्टि के लिए लड़ो (१४२९ और १८२२), किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (2-2003-525), वेलकम ट्रस्ट (074648/ ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन (PG/11/94/29169), HSC आर एंड डी श्रेणी (STL/4748/13) और MRC (MC_PC_15026) ।
Materials
| Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
| Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
| Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
| Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
| Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
| Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
| Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
| Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
| Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
| Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
| Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
| Pressure myography | |||
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
| Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
| Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Patch clamping | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
| Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
| Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
| Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
| Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Ca2+ imaging | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
| x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
| Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
| Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
| On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
| Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |
Referências
- Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
- Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
- Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?. Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
- Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
- Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
- Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
- Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
- Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
- Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
- Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
- McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
- Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
- Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording, Second Edition. , 53-90 (1995).
- Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
- McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
- Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
- McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
- McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
- Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
- Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
- Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
- P, S. k. o. v. . J. e. n. s. e. n. ., S, M. e. t. z. . M. a. r. i. e. n. d. a. l. . P. e. d. e. r. s. e. n., Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).
Citar este artigo
Curtis, T. M., McLaughlin, D., O’Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).