Detta manuskript beskriver ett enkelt protokoll för isolering av arterioler från råtta näthinnan som kan användas i elektrofysiologiska, kalcium imaging och tryck myography studier.
Näthinnan är en mycket metaboliskt aktiva vävnader som kräver en betydande blodtillförsel. Retinala cirkulationen stöder inre näthinnan, medan de koroidala kärl leverera fotoreceptorer. Förändringar i retinal perfusion bidrar till många synhotande störningar, inklusive diabetesretinopati, glaukom och retinal gren ven ocklusioner. Förstå de molekylära mekanismerna som är inblandade i kontrollen av blodflödet genom näthinnan och hur dessa förändras under okulär sjukdom kan leda till identifiering av nya mål för behandling av dessa tillstånd. Retinal arterioler är huvudsakliga motstånd blodkärlen i näthinnan, och följaktligen en viktig roll i regleringen av retinal hemodynamiken genom förändringar i luminala diameter. Under de senaste åren har vi utvecklat metoder för att isolera arterioler från råtta näthinnan som lämpar sig för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellstudier fysiologi. Detta preparat har redan börjat ge nya insikter i hur blodflödet styrs i näthinnan och har gjort det möjligt för oss att identifiera några av de viktiga förändringar som inträffar under okulär sjukdom. I denna artikel, vi beskriva metoder för isolering av råtta retinal arterioler och inkluderar protokoll för deras användning i patch-clamp elektrofysiologi, kalcium imaging och tryck myography studier. Dessa fartyg är också mottaglig för användning i PCR-, western blotting och immunohistokemi-baserade studier.
Förstå hur blodflödet kontrolleras i näthinnan är ett viktigt mål, eftersom onormala blodflödet har varit inblandade i patogenesen vid en mängd synhotande retinala sjukdomar1,2,3, 4. Retinala cirkulationen, som levererar den inre retinala nervceller och stödjeceller, har ett slutet artär arrangemang, med alla blodet från retinala artärer och arterioler passerar genom kapillärerna till retinal venoler och slutligen vener5. Blodflödet i näthinnan regleras av tonen i näthinnans artärer och arterioler samt kontraktila aktiviteten av den pericyter som ligger på väggarna av retinal kapillärer och efter kapillär venoler6,7, 8. kontroll av retinal vaskulär tonen är komplex och moduleras av en rad ingångar från cirkulationssystemet och omgivande näthinnevävnad, inklusive blodgaser, cirkulerande molekyler och hormoner, och vasoaktiva ämnen frigörs från den retinal vaskulär endotel och macroglia9,10,11. De retinala arterioler är små arteriell grenarna av näthinnan och består av ett enda lager av vaskulära glatta muskelceller och ett innerfoder av längdriktningen ordnade endotelceller12,13, 14. dessa fartyg utgör den viktigaste platsen för vaskulär resistens inom retinala cirkulationen och därför spela en viktig roll i den lokala kontrollen av retinal blodflöde. Retinal arterioler reglera kapillär blodflödet i näthinnan av dilating eller bromsande deras luminala diameter, medieras av förändringar i vaskulär glatt muskulatur kontraktilitet10,15,16. Förstå de molekylära mekanismer genom vilka retinal arterioler reglera retinal perfusion kräver därför preparat där arteriolär glatta muskelceller kan nås och studerade under förhållanden så nära fysiologiska som möjligt.
Ex vivo preparat av isolerade retinala blodkärl ger tillgång till vaskulära glatta muskelceller, samtidigt som man behåller sin funktionalitet och sammankoppling med underliggande endotelet. De flesta studier hittills använda isolerade fartyg har fokuserat på stora nötkreatur eller svin arteriell kärl (60-150 µm). Dessa kan monteras i kommersiellt tillgängliga tråd eller trycket myograph system för att aktivera farmakologiska förhör av vaskulär glatt muskulatur cell kontraktila mekanismer17,18. Sådana preparat har kraftigt bidragit till vår kunskap om retinal vaskulär fysiologi under normala förhållanden. Få studier har använt retinal arterioler isolerade från små försöksdjur som sin mindre diameter (~ 8-45 µm) förhindrar deras användning i konventionella myography system19,20,21,22. En viktig fördel, dock är med fartyg från små försöksdjur den stora tillgången på genetiskt modifierade, genmanipulerad och retinal sjukdomsmodeller. Litet laboratoriedjur är också mer mottaglig för i vivo interventionsstudier.
Här beskriver vi enkelt protokoll för isolering och cannulating råtta retinal arterioler för tryck myography experiment. Ca2 + imaging och elektrofysiologi protokoll med hjälp av dessa fartyg är också detaljerade. Dessa kan ge ytterligare insikter om regleringen av vaskulär glatt muskulatur kontraktilitet och blodflödet i näthinnan.
De protokoll som beskrivs ovan kräver praxis men bör uppnås med minimal felsökning. En genomsnittlig dag skulle vi få 6-8 användbara arterioler från isolering och uppnå 3-4 framgångsrika experiment. Om problem påträffas, men finns det några steg som kan vidtas för att förbättra framgång priser. Ibland har vi funnit, särskilt när du använder yngre råttor (< 8 veckor), att avkastningen av arterioler kan vara låg. För att kringgå problemet, skulle vi föreslå centrifugering retinala vävnaden (10-30 s vid 500 x g) mellan var och en av triturationen steg i steg 1.12-1,14. Detta hjälper till att förbättra avkastningen av fartyg ofta men kommer också att öka mängden cellfragment inom beredning.
När cannulating fartyg för tryck myography studier är det viktigt att kontrollera arterioler noggrant för någon sida-grenar som kan har varit tätt nära webbplatsen bifurkation. Detta utgör en vanlig orsak till läckage och tryckfall under experiment. Den viktigaste frågan som kan uppstå med [Ca2 +]jag protokollen är nivån på dye lastning. Dålig dye lastning leder till lågt signal-till-brus-förhållande, medan överbelastning resulterar i störningar av normal Ca2 + homeostas. För att minska sannolikheten för något av dessa problem, en liten alikvot av retinal Homogenatet kan avlägsnas, och isolerade fartyg kontrolleras regelbundet under lastning protokollet. När företaget patch-clamp experiment, andelen framgångsrika gigaseal bildandet är starkt beroende av hur väl har den basala lamina varit smält. När först testa detta protokoll eller använda nya massor av enzymer kan det nödvändigt att justera koncentration/varaktighet enzym matsmältningen. Noggrant övervaka separation av endothelial och smidig muskel lagren kommer att säkerställa tillräcklig matsmältningen ta bort nog basala laminal att få tillgång. Noggrann övervakning är också nödvändigt att undvika överdriven matsmältningen, vilket kan yttra sig som fartyget börjar att tygla. Om detta inträffar, är glatta muskelceller ofta alltför bräcklig för patch clamp inspelning. Vid tillämpning av enzymer, det är viktigt att inkludera DNAS I att säkerställa borttagning av strängar av DNA befriade från skadade celler under processen isolering. DNA-fragment är klibbiga och orsaka tången att följa arteriole under slutfasen av reningsprocessen (steg 4,4), ofta resulterar i fartyget förlust. Rengöring av fartyg är tekniskt svåra och utförs bäst vid hög förstoring (20 X) med mjuka svepande rörelser av stängt pincett av finaste möjligt spets diameter. Mellan sveper, rengöra tången med lab roll.
Som framhållits tidigare var en viktig motivation bakom utvecklingen av de protokoll som beskrivs i detta manuskript att bättre förstå varför blodflödet störs under retinala vaskulära sjukdomar. De flesta av vårt arbete hittills har fokuserat på diabetiker öga sjukdom28,33. Arterioler kan isoleras från näthinnor av experimentella djurmodeller för diabetes med hjälp av de metoder som beskrivs i avsnitt 1. När experimentera på isolerade retinal arterioler från diabetiska djur, är det viktigt att försöka nära replikera hyperglykemiska villkor upplevs av de fartyg i vivo. Därför skulle vi normalt höja D-glukos nivåerna i vår isolering och experimentella lösningar till 25 mM. Förtjockning av vaskulär källaren membran är ett välkänt fenomen i retinala kärl under diabetes34,35. När du använder djur med långvarig diabetes (> 1 månader sjukdom varaktighet), är ökad enzym koncentrationer eller matsmältningen gånger ofta nödvändiga för att tillämpningen av patch-clamp inspelning metoder.
En viktig begränsning av använda ex vivo isolerade retinal arterioler att studera retinal vaskulär fysiologi och patofysiologi är förlusten av den omgivande retinal neuropile. Även om borttagning av retinal gliaceller och neuronala celler ger enkel tillgång till de retinala vaskulära glatta muskelcellerna för fysiologi cellstudier, kan svar på fartygen vasoaktiva medlare förändras dramatiskt i frånvaro och närvaro av retinal vävnad. Åtgärder av adenosin-tri-fosfat (ATP), exempelvis ge en bra illustration av denna punkt. I isolerade råtta retinal arterioler, tillägg av ATP utlöser en robust förträngning fartyg36, medan i närvaro av en intakt neuropile, kärlen vidgas37. Därför där så är möjligt, försöka vi brukar validera viktiga resultat från våra isolerade arteriole förberedelser använda ex vivo retinal hela-fästen och i vivo mätningar av fartyget diameter och blod flöde16,37 . Notera uppstått nyligen nya metoder för att studera små arterioler och kapillärer i hela perfunderade svin näthinnor ex vivo38,39. Sådana preparat är sannolikt att avsevärt förbättra vår förståelse av hur den retinala neuropile reglerar retinal arteriolär och kapillär ton och hur förändringar i näthinnans hemodynamik modulera neuronal aktivitet i näthinnan.
Även om de förfaranden som beskrivs i denna uppsats fokuserar på användningen av isolerade råtta retinal arterioler för förståelse arteriolär muskulatur cellfysiologi, utvecklar vi för närvarande protokoll för att även möjliggöra studiet av endotelceller funktion i dessa fartyg. I förarbete, har vi varit framgångsrika i ändrande enzymatisk nedbrytning av retinal arteriolär segment att ge livskraftiga endotelceller rör som är Ca2 + imaging och patchclamp inspelning studier. Kanylering av de isolerade arterioler i båda ändar, att aktivera intraluminal leverans av narkotika, kunde i framtiden också aktivera endotel-beroende vasodilaterande Svaren ska undersökas i dessa fartyg.
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen av de protokoll som beskrivs i denna uppsats stöddes av bidrag från finansiärer om följande: BBSRC (BB/I026359/1), kampen för syn (1429 och 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), Brittiska hjärtat Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) och MRC (MC_PC_15026).
Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
Pressure myography | |||
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Patch clamping | |||
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Ca2+ imaging | |||
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |