ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח
Summary
ספקטרומטר מסה של ספריי עלה היא טכניקה ניתוח כימי ישיר זה ממזער את הכנת הדוגמא ומסלקת כרומטוגרפיה, המאפשר איתור מהיר של מולקולות קטנות רקמות הצמח.
Abstract
הצמחים מייצרים אלפי מולקולות קטנות מגוונים תכונותיהם הכימית. ספקטרומטר מסה (MS) היא טכניקה חזקה לניתוח מטבוליטים הצמח מכיוון שהוא מספק מולקולרית משקולות עם רגישות גבוהה. עלה ספריי MS הוא טכניקה יינון הסביבה שבו רקמת הצמח משמש לניתוח כימי ישיר דרך ספקטרומטריית electrospray, סילוק גזים מהתהליך. גישה זו הדגימה מטבוליטים מאפשר מגוון רחב של מחלקות כימי יזוהו בו זמנית של רקמות הצמח ללא פגע, למזער את כמות הכנת הדוגמא הדרושים. בעת שימוש עם MS המוני ברזולוציה גבוהה, מדויקת, עלה ספריי MS מקלה על גילוי מהיר של מטבוליטים של ריבית. זה גם אפשרי לאיסוף נתונים פיצול tandem המוני בטכניקה זו כדי להקל על זיהוי המורכב. השילוב של מדידות מדויקות המוני הפיצול הוא מועיל המאשרת זהויות מורכבים. התרסיס עלה MS הטכניקה דורש רק שינויים מזעריים מקור יינון nanospray, הוא כלי שימושי להרחיב את היכולות של ספקטרומטר מסה. . הנה, רקמות עלים טריים של Sceletium tortuosum (חיעדיים), צמח מרפא מסורתי מדרום אפריקה, ניתוח; אלקלואידים mesembrine רבים מזוהים עם תרסיס עלה MS.
Introduction
צמחים מכילים מגוון רחב של מולקולות קטנות עם מאפיינים כימיים מגוונים. MS היא טכניקה חזקה לניתוח תרכובות צמחים כי זה יכול לספק יצירות היסודות עם רגישות גבוהה, ירידה לפרטים עבור איתור וזיהוי של מטבוליטים1. ולרוב, MS מתבצע על הממס, חילוץ דגימות, אשר מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה לפני ניתוח MS1. עם זאת, השימוש של כרומטוגרפיה נוזלית (LC) דורש ניתוח ממושך פעמים, קשורה לעיתים קרובות עם הכנה דגימה נרחבת1. לעומת זאת, ניתוח כימי ישיר של רקמות ללא פגע העוקפות כרומטוגרפיה היא טכניקה מהירה מאוד, הדורשים הכנה מדגם מינימלי2. לפיכך, במקרים שבו יכול להיות forgone צעדים כרומטוגרפי, ניתוח כימי ישיר יכול להיות יתרון מאוד.
LC-MS טיפוסי למחקר גליקומיקס ומוצרים טבעיים מסתמך על עקירות בצובר ממושך של צמחים מיובשים או קפוא בחומרים המכילים מספר רקמות וכן סוגי תא3. לחלופין, אנליזה כימית ישיר, כגון זיהוי MS מטבוליטים מרקמות הצמח, ניתן לבודד את סוגי תאים ולהימנע הכנת חפצים4. תרסיס עלה MS, המכונה גם רקמות-תרסיס5,6, היא טכניקה יינון אמביינט ישירה MS, המחייב בעיקרו של דבר אין מדגם הכנה5,7. ריסוס העלים ש-MS קשורה קשר הדוק נייר ספריי MS, טכניקה יינון אמביינט עם מאפייני יינון ספקטרומטריית electrospray המאפשר איתור analytes אשר מופקדים על גבי נייר7. למרות השם, עלה ספריי MS החלים על סוגים שונים של רקמות הצמח לא רק עלים, כבר הפגינו על פירות, זרעים, שורשים, רקמות פרחים, פקעות, בין היתר6,8,9, 10,11,12. הטכניקה מקלה על יינון של פיטוכימיקלים אנדוגני ישירות מן החומרים צמח לתוך ספקטרומטר מסה זיהוי8. תרסיס עלה MS יכולים גם לספק מידע על חלוקת כימיקלים רקמות שונות סוגי צמחים13מרחבית. כאשר עלה ספריי MS מושווה עם מיצוי הממס, LC-MS, התוצאות להציע ספריי עלה ש-MS מאפשר איתור מטבוליטים משטח מהיר של סוגי תאים ייחודיים כגון trichomes13. איור 1 מדגימה הגדרת ניסיוני של ספריי MS עלה. יינון ישירה ספקטרומטריית electrospray מתרחשת לאחר רק מקור קטין שינויים. מתח גבוה מוחל על רקמת הצמח באמצעות מלחציים מתכת, ייצור תרסיס של droplets טעונה מאוד יוצרים קונוס טיילור שנושאת היונים לים יון של ספקטרומטריית Electrospray גב’ יינון מתרחשת הנוזל הטבעית של הצמח או של תפוח הממס מטען לשטח המפעל. קצה מחודד על הרקמה מקלה את ספקטרומטריית electrospray והוא יכול להיות באופן טבעי המתרחשים או שזה נוצר על ידי חיתוך.
תרסיס עלה MS היא שיטה מהירה לניתוח כמותיים למחצה של רקמות צמח שלם אשר נמצאו כלי שירות למגוון רחב של יישומים. לדוגמה, הטכניקה שימש כדי לזהות תרכובות אנדוגני כדי להבחין בין מינים קרובים, וכן אפילו להעריך שינויים מאותו המין גדל בתנאים שונים. מחקרים קודמים הראו גישה זו על ידי מדידת מטבוליטים ב- beautyberry (Callicarpa ל’) 12 ו ג’ינסנג אמריקאי (Panax quinquefolium ל’) 6. בדוגמה השנייה, ginsenosides, חומצות אמינו, oligosaccharides יכול להתגלות הרטבת ג’ינסנג raw רקמות. ג’ינסנג אמריקאי מעובדים הפראית היו תריז פקעת פרוסות6. ג’ינסנג פקעת שלמות השתמר מצליחה ספריי עלה MS, אשר אפשרה עבור בדיקת מיקרוסקופיים מורפולוגיים6. יתר על כן, תרכובות אקסוגני על דגימות צמח ניתן לזהות גם. מספר של חומרי הדברה (acetamiprid, diphenylamine, imazalil, linuron ו thiabendazole) זוהו על קליפת או ספרות זולה של פירות וירקות9. בעוד מחקרים אלה ועוד רבים אחרים הראו את התועלת של ספריי עלה MS למטרות ספציפיות שונות, פרוטוקול מפורט לא דווחה בעבר.
. הנה, התיאור פרוטוקול לא יתמקד אופטימיזציה של השיטה עבור רקמה ספציפית או מורכבים. במקום זאת, הגילוי של אלקלואידים mesembrine מן N.E.Br Sceletium tortuosum (ל’)-(חיעדיים) משמש כדוגמה כדי לדון בצעדים הדרושים אופטימיזציה שיש לנקוט בעת הגדרת ניסוי MS ספריי עלה על זן, רקמות, או compound(s) בפעם הראשונה. ס tortuosum היא מהם ייחודיים עסיסי האזור Karroo צחיח למחצה של דרום אפריקה. הרפואה המסורתית של ה-San חוי חוי העמים, היא שימשה תיאבון, צמא דיכוי גם באשר14,שלה השפעות תרופות פסיכוטרופיות כאבים15. כיום, תמציות מתוקננת משמשים לטיפול מנוטלי והפרעות שתלמידים16,17. תרכובות הראשי עניין כוללים את mesembrine אלקלואיד ונגזרותיו, שרבים מהם נמצאים גם מינים קרובים Sceletium 15. אוכלוסיות פרא והן מעובדות של tortuosum ס יש ריכוזים משתנים של אלקלואידים mesembrine, לכן הצגת האתגר של בקרת איכות18. שיטת איתור מהיר של אלקלואידים mesembrine, כגון תרסיס עלה MS, עשוי להיות שימושי פיקוח על מוצרים Sceletium . כי בעבר, היו לא מפורט חזותי נסיוני התרסיס עלה MS טכניקה, ימחיש לנו השיטה באמצעות הדוגמה של tortuosum סהבא מתואר: השינוי של מקור nanospray, מבחר, הכנה של רקמות הצמח, רכישת הנתונים, את הפרשנות של התוצאות, אופטימיזציה של הפרמטרים MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש המוצלח של פרוטוקול זה מסתמך על אופטימיזציה של השלבים השונים מיני צמחים, סוג הרקמה של המטרה compound(s) של עניין. שאר הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול לספק נקודת התחלה טובה. ההחלטות ניסיוני הבאים צריך להיות עשוי ונבדק: או לא שימוש (1) לחתוך או רקמות נימולים, הממס (2) או לא ממיס, (3) מה ממיס להשתמש בא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי המענק תכנית המחקר הגנום של צמח ה-NSF IOS-1238812, בתר ב ביולוגיה IOS-1400818. העבודה גם מומן על ידי מלגת סטודנט לתואר שני מונסנטו כדי קתרין א Sammons. אפריקה חוקר חוקרים תוכנית פולברייט (2017-2018) הוא הודה על מימון הוענק Nokwanda פ Makunga. אנו מעריכים מאוד את התרומה של מקור nanospray של ג’סיקה Prenni ואת המתקן פרוטאומיקס, גליקומיקס באוניברסיטת קולורדו.
Materials
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest – S. tortousum |
Referências
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography – mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
