Visualisere samspillet mellem Qdot-mærket Protein og Site-specifically modificeret λ DNA på enkelt-molekyle niveau
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at studere DNA-protein interaktioner af total interne reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) ved hjælp af en site-specifically modificerede λ DNA substrat og en kvante-dot mærket protein.
Abstract
Fluorescens mikroskopi har gjort store bidrag i dissekere mekanismerne af komplekse biologiske processer på enkelt-molekyle niveau. I enkelt molekyle assays for at studere DNA-protein interaktioner, der er to vigtige faktorer i betragtning: DNA substrater med nok længde til nem observation og mærkning et protein med en egnet fluorescerende sonde. 48.5 kb λ DNA er en god kandidat til DNA substrat. Quantum dots (Qdots), tillade som en klasse af fluorescerende sonder, mangeårige observation (minutter til timer) og høj kvalitet image erhvervelse. I dette papir præsenterer vi en protokol for at studere DNA-protein interaktioner på enkelt-molekyle niveau, som omfatter forbereder en site-specifically modificerede λ DNA og mærkning en target protein med streptavidin-belagt Qdots. For en proof of concept, vi vælge ORC (oprindelse anerkendelse komplekse) i spirende gær som et protein af interesse og visualisere dets interaktion med en ARS (selvstændigt replicerer sekvens) ved hjælp af TIRFM. Sammenlignet med andre fluorescerende sonder, Qdots har åbenlyse fordele i enkelt-molekyle studier på grund af dets høje stabilitet mod photobleaching, men det skal bemærkes, at denne egenskab begrænser dets anvendelse i kvantitative assays.
Introduction
Interaktioner mellem proteiner og DNA er afgørende for mange komplekse biologiske processer, såsom DNA-replikation, DNA reparation og transskription. Selv om konventionelle tilgange har kastet lys over egenskaberne af disse processer, er mange vigtige mekanismer stadig uklare. For nylig, med de rivende udvikling enkelt molekyle teknikker, nogle af mekanismerne, der har været behandlet1,2,3.
Anvendelsen af enkelt-molekyle Fluorescens mikroskopi på visualisere protein-DNA interaktioner i real-time hovedsagelig afhænger af udviklingen af fluorescens påvisning og fluorescerende sonder. For et enkelt molekyle undersøgelse er det vigtigt at mærke protein af interesse med en egnet fluorescerende sonde, da fluorescens detektionssystemer er for det meste tilgængelige kommercielt.
Fluorescerende proteiner er almindeligt anvendt i Molekylærbiologi. Men lav fluorescerende lysstyrke og stabilitet mod photobleaching begrænse dens anvendelse i mange enkelt molekyle assays. Quantum dots (Qdots) er bittesmå lysemitterende nanopartikler4. På grund af deres enestående optiske egenskaber, Qdots er 10 – 20 gange lysere og flere tusinde gange mere stabil end den udbredte organiske farvestoffer5. Qdots har desuden en stor Stokes Skift (forskel mellem placeringen af excitations- og toppe)5. Således kan Qdots bruges til lang tid observation (minutter til timer) og erhvervelse af billeder med høj signal-støj-forhold, mens de ikke kan udnyttes i de kvantitative assays.
Til dato, der er to tilgange til at mærke en target protein med Qdots site-specifically: mærkning ved hjælp af Qdot-konjugeret primære eller sekundære antistoffer6,7,8; eller mærkning target proteinet med Qdots direkte, som er baseret på stærke samspillet mellem biotin og streptavidin9,10,11,12,13. Streptavidin-belagte Qdots er kommercielt tilgængelige. I vores undersøgelse for nylig, site-specifically biotinylated proteiner i spirende gær med høj effektivitet blev renset af co-overekspression af BirA og Avi-tagged proteiner i vivo10. Af følgende og optimering af enkelt-molekyle assays14,15,16,17, observerede vi samspillet mellem Qdot-mærket proteiner og DNA på enkelt-molekyle niveau bruger TIRFM10.
Her, vi vælger en spirende gær oprindelse anerkendelse komplekse (ORC), som kan specifikt genkender og binder sig til den selvstændigt replicerer sekvens (ARS), som vores protein af interesse. Følgende protokol præsenterer en trinvis vejledning i at visualisere samspillet mellem Qdot-mærket ORC med ARS ved hjælp af TIRFM. Udarbejdelse af site-specifically modificerede DNA substratet, DNA-biotinylation, coverslip rengøring, functionalization, flow-celle forsamling og enkelt-molekyle imaging er beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her, en protokol for at observere samspillet mellem den Qdot-mærket protein og site-specifically modificeret λ DNA ved hjælp af TIRFM i en flow-celle. De nødvendige skridt omfatter lokationsspecifikke ændring af DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip rengøring og functionalization, flow-celle forberedelse og enkelt-molekyle billeddannelse. Der er to centrale punkter, der bør bemærkes. Første, alle trinene involveret med λ DNA skal manipuleres forsigtigt for at mindske eventuelle skader, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Hasan Yardimci og Dr.Sevim Yardimci af Francis Crick Institut for art hjælpe i enkelt-molekyle eksperimenter, Dr. Daniel Duzdevich fra Dr. Eric C. Greene’s lab ved Columbia University, Dr. Yujie Sun af Peking University og Dr. Chunlai Chen fra Tsinghua University for nyttig drøftelse. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS tværfaglig Innovation Team og den Newton avanceret Fellowship (NA140085) fra Royal Society.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
Referências
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
