基于交配的酵母超表达文库筛选
Summary
本文提出了一种基于交配的方法, 利用阵列质粒库, 促进萌芽酵母的超表达筛查。
Abstract
发芽酵母作为研究与人类疾病相关的蛋白质的模型被广泛应用。全基因组基因筛选是酵母研究中常用的有力工具。一些神经退行性疾病相关蛋白在酵母中的表达导致细胞毒性和聚集形成, 综述发现这些疾病的患者。在这里, 我们描述了一种筛选肌萎缩侧索硬化相关蛋白 FUS 酵母模型的方法, 以修饰其毒性。这个新的筛选平台不是使用转换, 而是依赖于酵母的交配来引入酵母模型中的粒度排列库。这种交配方法有两个明显的优点: 一是高效;二是将质粒预转换阵列库长期保存为甘油库存, 并可快速应用于其它筛网, 而不需要将劳动密集型的步骤转化为酵母模型。我们展示了这个方法如何能够成功地用于筛选基因, 改变 FUS 的毒性。
Introduction
酵母酵母菌在 1基础科学研究中得到广泛应用, 以了解与人类疾病直接相关的细胞过程。此外, 它被用作研究人类疾病相关蛋白的模型有机体, 例如与最常见的神经退行性疾病相关的蛋白质, 包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病和肌萎缩症。侧索硬化症 (ALS)2。酵母模型的优点是可以轻松地使用一个基因组范围的屏幕来识别与疾病相关蛋白的毒性相关的细胞通路, 从而对其毒性机制进行深入的研究。一个这样的屏幕被称为一个过度表达的图书馆屏幕, 其中5500酵母基因的排列库被转化为酵母模型, 以确定哪些基因可以修改毒性时抗原。这种筛选方法已成功地应用于多种神经退行性疾病相关蛋白的酵母模型中, 包括亨廷顿氏病的杭丁顿蛋白3、4、5 的α synuclein., Aβ阿尔茨海默氏病6, FUS 和 TDP-43 为 ALS7,8,9。虽然它通常是在高通量的方式10, 最劳动密集型的步骤的屏幕是单独转换5500酵母基因从阵列库。这一步必须在每次重复筛选时执行, 并且每当需要研究新建立的酵母模型时。找到一个更有效的方法来完成这项任务是很重要的。
酵母细胞可以稳定地存在于单倍体和双体形态中。单倍体细胞有两种相反的交配类型, 交配型 a 和α. 每种交配类型的单倍体细胞产生和分泌它们自己特定的交配信息素, 只有相反的交配型细胞反应。这允许在 a 和α细胞之间交配产生稳定的双倍细胞, a/α。这个过程是自发和高效率的11。我们可以利用这种独特的酵母生命周期来介绍质粒库。更具体地说, 阵列质粒库中的每个基因都将转化为一个交配型的单倍体细胞,即α细胞。这些含有库基因的细胞将会以96井格式排列的甘油储存。对于每个需要筛选的酵母模型, 含有该库基因的酵母细胞可以从甘油类中解冻, 通过与交配类型的感兴趣的酵母模型交配来进行筛选,即交配型 a。这种使用交配把两个基因放到酵母中的想法并不是新的。它已成功地应用于高通量酵母双杂交筛选中, 其中一个交配类型的诱饵构造 (即Gal4-DNA-binding 域融合) 通过与一个阵列库的猎物构造交配而聚集在一起。12. 然而, 这一战略从来没有被应用于过度表达的图书馆放映中, 因为它一直采用传统的转换方法。
我们的实验室以前建立了一个酵母模型的 ALS 相关蛋白 FUS7。通过使用转换方法进行过表达库筛选, 我们发现了五种酵母基因 (ECM32、NAM8、SBP1、SKO1和VHR1), FUS 时抢救抗原的毒性。这些发现被独立地证实了以相似的研究由另一组8。hUPF1, 人类同源的ECM32, 后来被证明抑制毒性的主要神经细胞13和在动物模型 ALS14以及。利用这五种基因作为原理证明, 我们证明, 在 FUS 酵母模型中, 通过交配, 所有的五种基因都类似地拯救了 FUS 毒性。由于含有库基因的酵母细胞可以永久储存在甘油库存中, 需要时恢复, 这种基于交配的方法将在每次需要筛选库时消除耗时的转换步骤。由于交配效率高, 不涉及质粒的转化, 这一策略也大大降低了大型质粒库的纯化和转化所带来的成本。我们将成功地将此方法应用于 FUS 酵母模型的图书馆筛选。
图 1简要介绍了基于交配的筛查程序。最初, 阵列质粒库被转化成一个单倍体酵母菌株的交配型α使用高通量酵母转化协议, 其中每个井的96井板含有酵母转化为特定的图书馆质粒。这种转化酵母的收集保存为甘油的股票, 可以解冻和恢复使用后。酵母模型的兴趣, 在这种情况下, FUS 毒性, 必须产生的单倍体酵母菌株与相反的交配类型 (交配型 a)。利用无菌96针复制器的高通量方式, 将含有质粒库的 FUS 菌株和酵母菌转移到含有丰富培养基的96井板上, 并允许交配。交配后, 每一个井的交配培养的小体积转移到96井板含有合成的辍学媒体, 其中只有双酵母含有 FUS 和图书馆的基因可以增长。然后利用机器人识别机将各井的酵母培养物转移到琼脂板上, FUS 和库基因的表达。 此外, 酵母培养被发现控制琼脂板块在那里 FUS 和图书馆基因没有表达。继琼脂板块生长后, 会发现拯救或加剧 FUS 毒性的基因。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个在酵母中执行质粒过度表达筛的协议, 将质粒库引入到酵母模型中。利用这种方法, 可以用同质粒库转化的同一株酵母, 筛选出多种神经退行性疾病蛋白毒性酵母模型。转化过程只需要进行一次, 然后用高效的酵母交配将质粒库引入到查询菌株中。该协议确实依赖于使用机器人设备来分配媒体和斑点酵母培养到琼脂板块。虽然可以在不使用机器人设备的情况下执行该协议, 但?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢与 Ju 实验室和中实验室的成员进行了深思熟虑的讨论, 以及莱特州立大学的财政支持。
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
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