Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure
Summary
Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.
Abstract
La levure de bière a été largement utilisée comme un modèle dans l’étude des protéines associées à des maladies humaines. Génome-large dépistage génétique est un outil puissant couramment utilisé dans les études de levure. L’expression d’un certain nombre de protéines associés à la maladie neurodégénérative levure provoque la cytotoxicité et formation globale, récapitulant les résultats observés chez les patients atteints de ces troubles. Nous décrivons ici une méthode de dépistage d’un modèle de la levure de la protéine associée à la sclérose latérale amyotrophique FUS pour les modificateurs de sa toxicité. Au lieu d’utiliser la transformation, cette nouvelle plateforme de projection s’appuie sur l’accouplement de levure pour introduire une bibliothèque déployèrent des plasmides dans le modèle de levure. La méthode d’accouplement a deux avantages : Premièrement, il est très efficace ; Deuxièmement, la bibliothèque déployèrent préalablement transformée des plasmides peut être conservée pendant à long terme comme un stock de glycérol et rapidement appliquée aux autres écrans sans la fastidieuse étape de transformation dans le modèle de levure chaque fois. Nous montrons comment cette méthode peut être utilisée avec succès pour dépister les gènes qui modifient la toxicité du FUS.
Introduction
La levure Saccharomyces cerevisiae a été employé couramment dans la recherche scientifique fondamentale1 pour comprendre les processus cellulaires directement liés aux maladies humaines. En outre, il a été utilisé comme un organisme modèle pour étudier les protéines associées à la maladie humaines, telles que celles liées aux maladies neurodégénératives plus courants, y compris la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la maladie de Huntington et amyotrophique Latérale amyotrophique (SLA)2. Un avantage du modèle levure est la facilité avec laquelle un génome-large écran peut être effectué afin d’identifier des voies cellulaires liés à la toxicité des protéines liées à la maladie, ce qui donne un aperçu sur le mécanisme de leur toxicité. Un tel écran est appelé un écran Bibliothèque surexpression, dans lequel chacun des 5 500 gènes levure dans une bibliothèque qui se transforme en un modèle de levure pour identifier quels gènes peuvent modifier la toxicité lorsque surexprimés. Cette méthode de dépistage a été appliquée avec succès dans les modèles de la levure de multiples protéines associés à la maladie de neurodégénératives, y compris la huntingtine pour la maladie de Huntington3, α-synucléine pour la maladie de Parkinson4,5 , Bêta-amyloïdes de la maladie d’Alzheimer,6et FUS et TDP-43 ALS7,8,9. Alors qu’il est généralement fait dans une manière haut débit10, l’étape la plus fastidieuse de l’écran se transforme individuellement 5 500 gènes de levure d’une bibliothèque de rangées. Cette étape doit être exécutée chaque fois que la projection est répétée, et chaque fois qu’un modèle de levure nouvellement créé doit être étudié. Il est important de trouver un moyen plus efficace pour accomplir cette tâche.
Les cellules de levure peuvent exister stablement sous forme haploïde et diploïde. Il y a deux en face de l’accouplement des types de cellules haploïdes, l’accouplement de type a et α. cellules haploïdes de chaque croisement type produire et sécrètent leur propre phéromone accouplement spécifique, auxquels répondent seules les cellules de type sexuel opposé. Cela permet l’accouplement entre un et α des cellules pour produire des cellules diploïdes stables, a/α. Ce processus est spontanée et très efficace11. Nous pouvons tirer profit de ce cycle de vie unique de S. cerevisiae d’introduire de la bibliothèque de plasmide. Plus précisément, chaque gène dans la bibliothèque de plasmide déployèrent se transformeront en cellules haploïdes d’un type sexuel, c’est-à-dire, cellule α. Ces cellules contenant les gènes de la bibliothèque seront alors stockées en stock de glycérol dans un format de 96 puits rangé. Pour chaque modèle de levure qui doit être projeté, contenant les gènes de la bibliothèque de cellules de levure peuvent être décongelés sur le stock de glycérol, et le dépistage peut être effectué via l’accouplement avec le modèle de levures d’intérêt dans le type sexuel opposé, c’est-à-diretype sexuel un. Cette idée d’utiliser l’accouplement de réunir les deux gènes dans la levure n’est pas nouveau. Elle a été appliquée avec succès dans la levure de haut-débit dépistage-hybride, dans lequel un appât construire (p. ex.fusions de Gal4-DNA-binding domain) dans un seul type d’accouplement est réuni par accouplement avec une proie de construction d’une bibliothèque de rangées 12. Toutefois, cette stratégie n’a jamais été appliquée dans la surexpression bibliothèque de films, qui ont toujours utilisé les méthodes traditionnelles de transformation.
Notre laboratoire a déjà établi un modèle de la levure de la protéine associée aux ALS FUS7. Par le biais de criblage de surexpression en utilisant la méthode de transformation, nous avons découvert cinq gènes de la levure (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1et VHR1) que sauver la toxicité du FUS lorsque surexprimés. Ces résultats ont été indépendamment confirmés avec une étude similaire réalisée par un autre groupe8. hUPF1, un homologue humain du ECM32, s’est avéré par la suite supprimer la toxicité des cellules neuronales primaires13 et dans un modèle animal de ALS14 établissements. À l’aide de ces cinq gènes comme preuve de principe, nous démontrons que tous les cinq gènes secourir de même toxicité FUS lorsqu’ils sont introduits dans le modèle de levure FUS par l’accouplement. Puisque les cellules de levure contenant les gènes de la bibliothèque peuvent être stockés en permanence en stock de glycérol et relancés chaque fois que nécessaire, cette méthode basée sur l’accouplement supprime la longue étape de transformation chaque fois que la bibliothèque doit être projeté contre. Étant donné que l’accouplement est très efficace avec aucune transformation de plasmide impliquée, cette stratégie diminue également de façon significative le coût associé à la purification et la transformation d’une bibliothèque de gros plasmide. Nous appliquerons avec succès cette méthode dans une bibliothèque de dépistage contre le modèle de la levure du FUS.
La procédure de dépistage basé sur l’accouplement est brièvement décrite à la Figure 1. Au départ, la bibliothèque du plasmide qui se transforme en une souche de levure haploïde de l’accouplement de type α, en utilisant un protocole de transformation de levure de haut-débit dans lesquels chaque puits d’une plaque 96 puits contient levure transformée avec un plasmide de bibliothèque spécifique. Cette collection de levure transformée est enregistrée comme un stock de glycérol qui peut être décongelé et relancé pour une utilisation plus tard. Le modèle de levures d’intérêt, dans cette affaire toxicité FUS, doit être généré dans une souche de levure haploïde avec le type sexuel opposé (type sexuel un). D’une manière de haut débit utilisant des réplicateurs de 96 broches stériles, le FUS souche souches de levure contenant la bibliothèque de plasmide transférés à plaques à 96 puits contenant des médias riches et sont autorisés pour s’accoupler. Après l’accouplement, un petit volume de chaque puits de la culture d’accouplement est transféré à plaques à 96 puits contenant des médias synthétiques d’abandon dans lequel levure uniquement diploïde contenant les deux Dug et gènes de bibliothèque peuvent se développer. Une machine robotisée tache sert ensuite de transférer la culture de levure de chaque puits, sur plaques de gélose, où l’expression des gènes Bibliothèque et FUS est induite. En outre, culture de levure est repérée pour contrôler les boîtes de gélose où FUS et les gènes de bibliothèque ne sont pas exprimées. Après une croissance sur milieu gélosé, gènes de sauvetage ou d’aggravent la toxicité FUS seront identifiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour effectuer un écran de surexpression de plasmide dans la levure à l’aide de l’accouplement d’introduire de la bibliothèque de plasmide dans le modèle de la levure. En utilisant cette approche, plusieurs modèles de levure de toxicité de protéine maladies neurodégénératives peuvent projetés à l’aide de la même collection de levure transformée avec une bibliothèque de plasmide. Le laborieux processus de transformation ne doit être effectuée une seule fois, après…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour des discussions approfondies avec les membres du laboratoire Ju et laboratoire de Zhong et le soutien financier de la Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
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