Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe
Summary
Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.
Abstract
Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.
Introduction
Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann, um zelluläre Signalwege, die im Zusammenhang mit der Toxizität von krankheitsbezogenen Proteine, wodurch Einblicke in den Mechanismus der Toxizität zu identifizieren. Ein solcher Bildschirm nennt einen Überexpression Bibliothek Bildschirm, in dem jedes 5.500 Hefe-Gene in einer angeordneten Bibliothek umgewandelt ist ein Hefe-Modell zu identifizieren, welche Gene Toxizität bei überexprimiert ändern können. Dieses Screening-Methode wurde erfolgreich in den Hefe-Modellen der mehrere Neurodegenerative Krankheit-verbundenen Proteine, einschließlich Huntingtin für Chorea Huntington3, α-Synuclein für Parkinson-Krankheit4,5 angewendet , Aβ für Alzheimer-Krankheit6, und FUS und TDP-43 ALS7,8,9. Während es in der Regel in einer Weise Hochdurchsatz-10erfolgt, ist die aufwändigste Schritt des Bildschirms individuell 5.500 Hefe-Gene aus einer angeordneten Bibliothek verändern. Dieser Schritt muss jedes Mal, wenn das Screening wiederholt durchgeführt werden, und wenn ein neu gegründeten Hefe-Modell untersucht werden muss. Es ist wichtig, einen effizienteren Weg, um diese Aufgabe zu finden.
Hefezellen können stabil in haploide und diploide Formen existieren. Es gibt zwei gegenüberliegende Paarung Arten von haploiden Zellen, Paarung Typ ein und α. haploiden Zellen von jeder Paarung produzieren und sezernieren ihre eigenen spezifischen Paarung Pheromon, auf die nur die entgegengesetzte Paarung Typ Zellen reagieren. Dies ermöglicht die Paarung zwischen ein und α Zellen, stabile diploide Zellen, a/α zu produzieren. Dieser Prozess ist spontan und hocheffiziente11. Wir profitieren von dieser einzigartigen Lebenszyklus von S. Cerevisiae , Plasmid-Bibliothek einzuführen. Genauer gesagt, wird jedes Gen in der angeordneten Plasmid-Bibliothek in haploiden Zellen eine Paarung Art, d. h., α Zellen umgewandelt werden. Diese Zellen mit den Genen der Bibliothek werden dann auf Glycerin Lager in einem angeordneten 96-Well-Format gespeichert werden. Für jedes Modell der Hefe, die untersucht werden muss, können Hefezellen mit den Bibliothek-Genen aus dem Glycerin bestand aufgetaut werden und das Screening kann erfolgen durch Paarung mit dem Hefe-Modell des Interesses an der gegenüberliegenden Paarung Typ, d.h.Paarung ein. Diese Idee der Verwendung Paarung von zwei Gene in der Hefe zusammenzubringen ist nicht neu. Es wurde erfolgreich in der Hochdurchsatz-Hefe angewendet, die zwei-Hybrid-Screening, in dem ein Köder zu konstruieren (d.h.Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionen) in einer Paarung zusammen gebracht wird, durch Paarung mit einer Beute-Konstrukt aus einer angeordneten Bibliothek 12. jedoch wurde diese Strategie nie in Überexpression Bibliothek Vorführungen, derer immer traditionelle Transformationsmethoden angewendet.
Unser Labor gegründet zuvor ein Hefe-Modell von ALS-assoziierten Protein FUS7. Durch Überexpression Bibliothek Screening mit der Transformationsmethode entdeckten wir fünf Hefe-Gene (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1), die Toxizität von FUS bei überexprimiert zu retten. Diese Ergebnisse waren unabhängig von einer anderen Gruppe8mit einer ähnlichen Studie bestätigt. hUPF1, eine menschliche Homolog des ECM32, wurde später gezeigt, Toxizität in primären Nervenzellen13 und im Tiermodell ALS14 sowie zu unterdrücken. Mit diesen fünf Gene als Kaufnachweis Prinzip, zeigen wir, dass alle fünf Gene ebenso FUS Toxizität zu retten, wenn sie bei der Paarung in die FUS-Hefe-Modell eingeführt werden. Da Hefezellen mit den Bibliothek-Genen können dauerhaft in Glycerin Lager gespeichert und wiederbelebt, wenn nötig, wird diese Paarung basierende Methode den zeitaufwendigsten Schritt der Transformation jedes Mal entfernen braucht die Bibliothek gegen untersucht werden. Da die Paarung hocheffiziente ohne Plasmid Transformation beteiligt ist, verringert sich diese Strategie auch erheblich die Kosten für Reinigung und Transformation einer großen Plasmid-Bibliothek. Wir wenden diese Methode erfolgreich zu einer Bibliothek screening gegen Hefe Modell des FUS.
Das Verfahren für die Paarung-basierten Screening ist in Abbildung 1kurz beschrieben. Zunächst die angeordneten Plasmid-Bibliothek verwandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm der Paarung Typ α mit einem Hochdurchsatz-Hefe Umwandlung Protokoll, in dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer bestimmten Bibliothek Plasmid transformiert Hefe enthält. Diese Sammlung von transformierten Hefe wird als Glycerin Stapel gespeichert, die aufgetaut und für den Einsatz später wiederbelebt werden kann. Das Hefe-Modell von Interesse, in diesem Fall FUS Toxizität muss in einem haploiden Hefestamm mit der gegenüberliegenden Paarung Art erzeugt werden (Typ Paarung ein). In gewissem Hochdurchsatz-mit sterilen 96-poligen Replikatoren die FUS Belastung und Hefestämme mit Plasmid-Bibliothek auf 96-Well-Platten mit rich-Media übertragen und erlaubt zu Paaren. Folgende Paarung, ein kleines Volumen von jedem Brunnen der Paarung Kultur wird in 96-Well-Platten mit synthetischen ausfallende Medien in welche nur diploid Hefe enthält sowohl die FUS übertragen und Bibliothek Gene wachsen können. Eine Roboter-spotting Maschine dient dann Hefekultur von jedem Bohrloch auf Agarplatten zu übertragen, wo der Ausdruck der FUS und die Bibliothek Gene induziert wird. Darüber hinaus ist Hefekultur gesichtet, um Agarplatten zu steuern, wo FUS und die Bibliothek Gene nicht zum Ausdruck kommen. Nach einem Wachstum auf Agarplatten werden Gene, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität identifiziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
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