Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito
Summary
Questo articolo presenta un metodo basato sull’accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.
Abstract
Lievito è stato ampiamente utilizzato come modello nello studio di proteine associate a malattie umane. Lo screening genetico del genoma è un potente strumento comunemente utilizzato negli studi di lievito. L’espressione di un numero di proteine associate malattia di neurodegenerative in lievito causa citotossicità e formazione aggregata, ricapitolare i risultati osservati in pazienti con questi disturbi. Qui, descriviamo un metodo per lo screening di un modello di lievito della sclerosi laterale amiotrofica-associati proteina FUS per i modificatori della sua tossicità. Invece di utilizzare la trasformazione, questa nuova piattaforma di screening si basa sull’accoppiamento di lievito per introdurre una libreria disposte dei plasmidi nel modello del lievito. Il metodo di accoppiamento ha due vantaggi: in primo luogo, è altamente efficiente; in secondo luogo, la libreria allinearono pre-trasformata dei plasmidi possa essere memorizzata per a lungo termine come uno stock di glicerolo e rapidamente applicata agli altri schermi senza il passaggio di alta intensità di lavoro di trasformazione nel modello del lievito ogni volta. Dimostriamo come questo metodo può essere utilizzato con successo per geni che modificano la tossicità del FUS.
Introduction
Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente usato nella ricerca scientifica di base1 di comprendere processi cellulari direttamente correlati alle malattie umane. Inoltre, è stato utilizzato come organismo modello per lo studio di proteine umane di malattia-collegati, come quelli legati a malattie neurodegenerative più comuni, tra cui il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e amiotrofica Sclerosi laterale (ALS)2. Un vantaggio del modello del lievito è la facilità con cui può essere eseguita una schermata di genoma per identificare vie cellulari correlate alla tossicità delle proteine correlate a malattia, dando così la comprensione nel meccanismo della loro tossicità. Una tale schermata viene chiamata uno schermo di sovraespressione biblioteca, in cui ciascuno dei 5.500 geni lievito in una libreria di serie si trasforma in un modello di lievito per identificare quali geni possono modificare tossicità quando sovraespresso. Questo metodo di screening è stato applicato con successo nei modelli lievito di più proteine associate a malattia di neurodegenerative, tra cui huntingtina per la malattia di Huntington3, α-synuclein per la malattia del Parkinson4,5 , Aβ per morbo di Alzheimer6e FUS e TDP-43 per ALS7,8,9. Mentre di solito è fatto in un modo ad alta velocità10, il passo più laborioso dello schermo sta trasformando individualmente 5.500 geni di lievito da una libreria disposte. Questo passaggio deve essere eseguita ogni volta che lo screening viene ripetuto, e ogni volta che un modello di nuova costituzione lievito deve essere studiato. È importante trovare un modo più efficiente per eseguire questa operazione.
Cellule di lievito stabile possono esistere in forme sia aploide e diploide. Ci sono due opposti tipi di cellule aploidi, accoppiamento tipo di accoppiamento un e α. cellule aploidi di ogni accoppiamento tipo producono e secernono il proprio specifico feromone accoppiamento, a cui rispondono solo le celle di tipo accoppiamento opposto. Questo consente di accoppiamento tra un e α cellule per produrre cellule diploidi stabile, a/α. Questo processo è spontaneo e altamente efficiente11. Possiamo prendere vantaggio di questo unico ciclo di vita di S. cerevisiae per introdurre la libreria di plasmide. Più in particolare, ogni gene nella libreria allinearono plasmide si trasformerà in cellule aploidi di un tipo di accoppiamento, cioè, delle cellule α. Queste cellule contenenti i geni di libreria quindi saranno conservate in magazzino di glicerolo in un formato di 96 pozzetti disposte. Per ogni modello di lievito che deve essere proiettato, cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere scongelate dallo stock glicerolo, e lo screening può essere fatto attraverso l’accoppiamento con il modello di lievito di interesse per il tipo accoppiamento opposto, vale a dire, tipo accoppiamento un. Questa idea dell’utilizzo di accoppiamento per riunire due geni in lievito non è nuova. È stato applicato con successo nel lievito high throughput screening due-ibrido, in cui un esca costruiscono (cioè, fusioni di dominio Gal4-DNA-binding) in un tipo di accoppiamento è riuniti attraverso l’accoppiamento con un costrutto di preda da una libreria disposte 12. Tuttavia, questa strategia non è stato mai applicata in proiezioni biblioteca sovraespressione, che hanno sempre usato metodi di trasformazione tradizionali.
Il nostro laboratorio precedentemente stabilito un modello di lievito del ALS-collegato della proteina FUS7. Attraverso lo screening di biblioteca di sovraespressione utilizzando il metodo di trasformazione abbiamo scoperto cinque geni di lievito (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) che tossicità di FUS quando sovraespresso di soccorso. Questi risultati sono stati confermati in modo indipendente con uno studio simile di un altro gruppo8. hUPF1, un omologo umano di ECM32, più successivamente è stato indicato per sopprimere tossicità in cellule neuronali primarie13 e in un modello animale di ALS14 pure. Utilizzando questi cinque geni come prova di principio, dimostriamo che tutti e cinque i geni salvare tossicità FUS allo stesso modo quando vengono introdotte nel modello del lievito FUS di accoppiamento. Poiché le cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere memorizzate permanentemente in Stock in glicerolo e rivivere ogni volta che necessario, questo metodo basato sull’accoppiamento rimuoverà il passo che richiede tempo di trasformazione ogni volta che la libreria deve essere schermato contro. Dato che l’accoppiamento è altamente efficiente, con nessuna trasformazione di plasmide coinvolta, questa strategia diminuisce anche significativamente il costo associato di purificazione e trasformazione di una libreria di grande plasmide. Si applicherà con successo questo metodo in una libreria di screening contro il modello di lievito di FUS.
La procedura per lo screening basato sull’accoppiamento è brevemente descritta nella Figura 1. Inizialmente, la biblioteca di plasmide allinearono si trasforma in un ceppo di lievito aploidi di accoppiamento tipo α utilizza un protocollo di trasformazione del lievito di alto-rendimento in cui ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contiene lievito trasformato con un plasmide di libreria specifica. Questa raccolta di lievito trasformato viene salvata come uno stock di glicerolo che può essere scongelato e fatto rivivere per uso più tardi. Il modello di lievito di interesse, in questa cassa tossicità FUS, deve essere generato in un ceppo di lievito aploidi con il tipo di accoppiamento opposto (accoppiamento tipo un). In un modo ad alta velocità utilizzando sterile 96-pin replicatori, il ceppo FUS e ceppi di lievito che contiene la libreria di plasmide sono trasferiti per piastre da 96 pozzetti contenenti contenuti multimediali e permesso di mate. Dopo l’accoppiamento, un piccolo volume da ogni bene della cultura accoppiamento viene trasferito per piastre da 96 pozzetti contenenti media sintetico abbandono nel quale lievito solo diploide contenente entrambe le unità follicolari e geni di libreria possono crescere. Una macchina robotica spotting viene quindi utilizzata per trasferire cultura lievito da ciascun pozzetto su piastre di agar dove viene indotta l’espressione del FUS e i geni di biblioteca. Inoltre, la coltura di lievito è macchiato per controllare le piastre di agar dove FUS e i geni della biblioteca non sono espressi. A seguito di crescita su piastre di agar, saranno identificati geni che salvare o aggravano la tossicità FUS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per eseguire una schermata di sovraespressione di plasmide in lievito mediante accoppiamento per introdurre la libreria di plasmide nel modello del lievito. Utilizzando questo approccio, più modelli di lievito della tossicità delle proteine malattia neurodegenerative possono essere selezionate utilizzando la stessa raccolta di lievito trasformata con una libreria di plasmide. Solo il laborioso processo di trasformazione deve essere eseguita una volta, dopo quale lievito altamente efficien…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per la premurose discussioni con i membri del laboratorio Ju e laboratorio di Zhong e il sostegno finanziario da Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
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