Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær
Summary
Denne artikkelen presenterer en parring-basert metode for å lette overuttrykte screening i spirende gjær bruker en plassert plasmider biblioteket.
Abstract
Spirende gjær har vært mye brukt som modell i å studere proteiner knyttet til menneskelige sykdommer. Genomet hele genetisk screening er et kraftig verktøy som vanligvis brukes i gjær studier. Uttrykk for en rekke nevrodegenerative sykdomsassosierte proteiner i gjær fører cytotoksisitet og samlet formasjon, recapitulating funn sett hos pasienter med disse lidelser. Her beskriver vi en metode for screening gjær modell av amyotrofisk Lateral sklerose-assosiert protein FUS for modifikatorer sin toksisitet. Istedet for benytter transformasjon, avhengig denne nye screening plattformen mating av gjær å innføre et plassert bibliotek av plasmider i gjær modellen. Parring metoden har to klare fordeler: for det første er svært effektiv; andre kan pre transformert plassert biblioteket av plasmider lagres for langsiktige som en glyserol lager og raskt anvendt til andre skjermer uten arbeidskrevende trinn av transformasjon i gjær modellen hver gang. Vi viser hvordan denne metoden kan med hell brukes til skjermen for tilblivelse endre toksisitet av Fu.
Introduction
Spirende gjær Saccharomyces cerevisiae har vært mye brukt i grunnleggende forskning1 for å forstå cellulære prosesser direkte knyttet til menneskelige sykdommer. Dessuten, det har blitt brukt som en modell organisme for studerer menneskelig sykdomsassosierte proteiner, slik som knyttet til de vanligste nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og amyotrofisk Lateral sklerose (ALS)2. En fordel med gjær modellen er enkelt som et genom-widescreen kan utføres for å identifisere mobilnettet veiene gjelder toksisitet av sykdom-relaterte proteiner, dermed gi innsikt i mekanismen av giftigheten. En slik skjerm kalles en overuttrykte biblioteket skjerm, der hver av 5500 gjær genene i en plassert biblioteket er forvandlet til en gjær-modellen for å identifisere hvilke gener kan endre toksisitet når overexpressed. Denne metoden screening har vært anvendt gjær modeller av flere nevrodegenerative sykdomsassosierte proteiner, inkludert huntingtin for Huntingtons sykdom3, α-synuclein for Parkinsons sykdom4,5 , Aβ for Alzheimers6, og Fu og TDP-43 for ALS7,8,9. Mens det er vanligvis gjort i en høy gjennomstrømming måte10, transformerer det mest arbeidskrevende trinnet av skjermen individuelt 5500 gjær gener fra et plassert bibliotek. Dette trinnet må utføres hver gang Screeningen gjentas, og når en nyetablerte gjær modellen må studeres. Det er viktig å finne en mer effektiv måte å utføre denne oppgaven.
Gjærceller kan stabilt finnes i både haploid og diploide. Det er to motsatte mating haploid cellene, parring type en og α. Haploid celler av hver mating produserer og skiller ut sine egne spesifikke parring feromon, som bare de motsatte parring type cellene reagerer. Dette gjør mating imellom en og α celler til å produsere stabil diploide celler, en/α. Denne prosessen er spontan og svært effektiv11. Vi kan dra nytte av denne unike livssyklusen til S. cerevisiae å innføre plasmider biblioteket. Mer spesifikt, vil hver genet i plassert plasmider biblioteket bli forvandlet til haploid celler av en parring type, dvs, α-cellen. Disse cellene som inneholder biblioteket genene lagres deretter på glyserol lager i plassert 96-brønns format. For hver gjær modell som skal bli vist, gjærceller som inneholder biblioteket genene kan være tint fra glyserol lager og screening kan gjøres gjennom parring med gjær modell av interesse i motsatt parring type, dvsparring type en. Denne ideen om å bruke parring for å bringe sammen to gener i gjær er ikke nytt. Det har vært anvendt i høy gjennomstrømming gjær to-hybrid screening, som et agn konstruere (dvs.Gal4-DNA-bindende domene fusjoner) i én parring er samlet gjennom parring med en prey konstruere fra et plassert bibliotek 12. men denne strategien er aldri brukt i overuttrykte bibliotek screenings, som alltid har brukt tradisjonelle transformasjon metoder.
Vårt laboratorium etablerte gjær modell av ALS-assosiert protein FUS7. Gjennom overuttrykte biblioteket screening med metoden transformasjon oppdaget vi fem gjær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1og VHR1) som redde toksisitet av FUS når overexpressed. Disse funnene ble uavhengig bekreftet med en liknende studie av en annen gruppe8. hUPF1, en menneskelig homolog av ECM32, ble vist å undertrykke toksisitet i primære neuronal celler13 og i en dyremodell ALS14 også. Bruke disse fem gener som bevis på prinsippet, viser vi at alle fem gener tilsvarende redde FUS toksisitet når de blir introdusert inn i FUS gjær modellen av parring. Siden gjærceller som inneholder biblioteket genene kan lagret permanent på glyserol lager og gjenopplivet når nødvendig, fjernes denne parring-basert metode tidkrevende trinn av transformasjon hver gang biblioteket må bli vist mot. Siden parring er svært effektiv med ingen plasmider transformasjon involvert, reduserer denne strategien også betydelig kostnadene forbundet med rensing og transformasjon av et stort plasmider bibliotek. Vi vil kunne bruke denne metoden et bibliotek screening mot gjær modell av Fu.
Fremgangsmåten for parring-basert screening er kort beskrevet i figur 1. I utgangspunktet er plassert plasmider biblioteket forvandlet til en haploid gjær stamme av parring type α bruker en høy gjennomstrømming gjær transformasjon protokoll der hver brønn av en 96-brønns plate inneholder gjær forvandlet en bestemt bibliotek plasmider. Denne samlingen av transformert gjær lagres som en glyserol lager som kan Tint og gjenopplivet for bruk senere. Gjær modellen av interesse, i dette tilfellet FUS toksisitet, må genereres i en haploid gjær belastning med motsatt parring type (parring type en). I en høy gjennomstrømming måte bruke sterilt 96-pinners replikatorer, Fu påkjenningen og gjær påkjenningen inneholder plasmider biblioteket overført til 96-brønns plater som inneholder rik media og lov til å mate. Etter parring, et lite volum fra hver brønn parring kultur overføres til 96-brønns plater som inneholder syntetisk dropout medier i som bare diploide gjær som inneholder begge Fu og biblioteket gener kan vokse. En robot småblødninger maskin brukes deretter overføre gjær kultur fra hver brønn på agar plater der uttrykk for Fu og biblioteket genene er indusert. I tillegg er gjær kultur oppdaget for å kontrollere agar plater der Fu og biblioteket genene ikke er uttrykk. Etter vekst på agar plater, gener som redde eller forverre FUS toksisitet vil bli identifisert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for å utføre en plasmider overuttrykte skjerm i gjær bruker parring for å innføre plasmider biblioteket i gjær modellen. Bruker denne tilnærmingen, kan flere gjær modeller neurodegenerative sykdom protein toksisitet bli vist med samme samling av gjær forvandlet med plasmider biblioteker. Møysommelige prosessen med transformasjon må bare utføres når, etter som svært effektiv gjær parring brukes å innføre plasmider biblioteket i spørringen belastningen. Denne protokollen avhe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for de gjennomtenkte diskusjonene med medlemmer av Ju laboratoriet og Zhong laboratorium og økonomisk støtte fra Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genética. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
