Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento
Summary
Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.
Abstract
Brotamento de levedura tem sido amplamente utilizada como modelo no estudo de proteínas associadas a doenças humanas. Rastreio genético de todo o genoma é uma poderosa ferramenta comumente usada em estudos de levedura. A expressão de um número de proteínas de associada a doenças neurodegenerativas no fermento causa citotoxicidade e formação de agregados, sintetizando resultados vistos em pacientes com esses transtornos. Aqui, descrevemos um método para a seleção de um modelo de levedura da esclerose Lateral amiotrófica-associado proteína FUS para modificadores de sua toxicidade. Em vez de usar a transformação, esta nova plataforma de triagem depende do acasalamento de levedura para introduzir o modelo de fermento uma biblioteca matriz de plasmídeos. O método de acasalamento tem duas vantagens claras: em primeiro lugar, é altamente eficiente; em segundo lugar, a biblioteca matriz previamente transformada de plasmídeos pode ser armazenada para a longo prazo como um estoque de glicerol e rapidamente aplicada para outras telas sem a etapa de trabalho intensiva de transformação para o modelo de levedura cada vez. Demonstraremos como esse método pode ser usado com sucesso para triagem de genes que modificam a toxicidade de FUS.
Introduction
A brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada em pesquisa científica básica1 compreender processos celulares diretamente relacionados a doenças humanas. Além disso, ela tem sido usada como um organismo modelo para estudar proteínas humanas associadas a doenças, tais como aquelas ligadas a doenças neurodegenerativas mais comuns, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e amiotrófica Esclerose lateral (ALS)2. Uma vantagem do modelo de levedura é a facilidade com que uma tela de todo o genoma pode ser realizada para identificar caminhos celulares relacionados à toxicidade de doença relacionada com proteínas, dando assim a visão sobre o mecanismo de sua toxicidade. Um tal tela chama-se uma tela de biblioteca superexpressão, em que cada um dos 5.500 genes fermento em uma biblioteca de matriz é transformado em um modelo de levedura para identificar quais genes podem modificar toxicidade quando overexpressed. Este método de triagem foi aplicado com sucesso nos modelos de levedura de múltiplos neurodegenerativas associadas a doença proteínas, incluindo huntingtina para a doença de Huntington3, α-synuclein para a doença de Parkinson4,5 , Aβ para a doença de Alzheimer,6e FUS e TDP-43 para ALS7,8,9. Enquanto é feito geralmente em uma maneira do elevado-throughput10, o passo mais trabalhoso da tela está transformando individualmente 5.500 genes fermento de uma biblioteca de matriz. Esta etapa deve ser executada cada vez que o rastreio é repetido, e sempre que um modelo de levedura recém-criada precisa ser estudado. É importante encontrar uma maneira mais eficiente para realizar essa tarefa.
Células de levedura podem existir estàvel em formas haploides e diploides. Há dois opostos acasalar tipos de células haploides, tipo de acasalamento um e α. células haploides de cada acasalamento tipo produzem e secretam seu próprios pheromone acasalamento específico, ao qual apenas as células acasalamento tipo oposto respondem. Isso permite que o acasalamento entre um e células α para produzir células diploides estáveis, a/α. Este processo é espontânea e altamente eficiente de11. Que pode tirar proveito deste exclusivo do ciclo de vida de S. cerevisiae para introduzir a biblioteca do plasmídeo. Mais especificamente, cada gene na biblioteca do plasmídeo matriz será transformado em células haploides de um tipo de acasalamento, isto é, células α. Estas células que contêm os genes de biblioteca serão então armazenadas em estoque de glicerol em formato matriz de 96 poços. Para cada modelo de fermento que precisa ser rastreada, células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser descongeladas partir do estoque de glicerol, e o rastreio pode ser feito através de acasalamento com o modelo de leveduras de interesse o acasalamento tipo oposto, ou seja, acasalamento tipo um. A ideia de usar o acasalamento para reunir dois genes em fermento não é nova. Foi aplicado com sucesso no fermento do elevado-throughput rastreio do dois-híbrido, em que uma isca construir (ou seja, fusões de domínio Gal4-DNA-binding) em um tipo de acasalamento é reuniu através de acasalamento com uma presa de construção de uma biblioteca de matriz 12. no entanto, essa estratégia nunca foi aplicada em seleções de biblioteca superexpressão, que sempre usaram métodos de transformação tradicional.
Nosso laboratório anteriormente estabelecido um modelo de levedura do ALS-associada da proteína FUS7. Descobrimos que cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) que resgatar a toxicidade de FUS quando overexpressed através de triagem de superexpressão biblioteca usando o método de transformação. Estes resultados foram confirmados independentemente com um estudo semelhante por outro grupo8. hUPF1, um homólogo humano de ECM32, mostrou-se mais tarde para suprimir a toxicidade em células neuronais primária13 e em um modelo animal de ALS14 também. Usando estes cinco genes como prova de princípio, vamos demonstrar que todos os cinco genes da mesma forma resgatar toxicidade FUS quando são introduzidos no modelo de levedura FUS por acasalamento. Uma vez que as células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser armazenadas permanentemente em estoque de glicerol e revividas sempre que necessário, este método baseado em acasalamento removerá a etapa demorada de transformação cada vez que a biblioteca precisa ser protegidos contra. Desde que o acasalamento é altamente eficiente com nenhuma transformação do plasmídeo envolvida, esta estratégia também significativamente diminui o custo associado a purificação e a transformação de uma biblioteca grande plasmídeo. Vamos com êxito aplicar este método em uma biblioteca de triagem contra modelo de levedura de FUS.
O procedimento para a seleção com base em acasalamento é brevemente descrito na Figura 1. Inicialmente, a biblioteca de matriz do plasmídeo é transformada em uma cepa de levedura haploide de acasalamento tipo α usando um protocolo de transformação de levedura de alta produtividade em que cada poço de uma placa de 96 poços contém fermento transformado com um plasmídeo de biblioteca específica. Esta coleção de fermento transformado é salvo como um estoque de glicerol que pode ser descongelado e ressuscitado para uso mais tarde. O modelo de leveduras de interesse, na toxicidade FUS neste caso, deve ser gerado em uma cepa de levedura haploide com o tipo oposto de acasalamento (tipo de acasalamento um). De forma elevado-throughput usando estéril 96 pinos replicadores, a estirpe FUS e cepas de leveduras contendo a biblioteca do plasmídeo são transferidas para placas de 96 poços contendo mídia rica e permissão para companheiro. Após o acasalamento, um pequeno volume de cada poço de cultura acasalamento é transferido para placas de 96 poços contendo mídia desistente sintético no qual fermento apenas diploide que contém ambos os FUS e genes de biblioteca podem crescer. Uma máquina robótica spotting é usada para transferência de cultura de levedura de cada poço em placas de ágar, onde a expressão de FUS e os genes de biblioteca é induzida. Além disso, a cultura de levedura está manchada para controlar placas de ágar, onde FUS e os genes de biblioteca não são expressos. Após crescimento em placas de ágar, serão identificados os genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade FUS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para executar uma tela de superexpressão do plasmídeo no fermento usando o acasalamento para introduzir o modelo de fermento a biblioteca do plasmídeo. Usando essa abordagem, vários modelos de levedura de toxicidade de proteína de doenças neurodegenerativas podem ser selecionados usando a mesma coleção de fermento transformado com uma biblioteca de plasmídeo. O laborioso processo de transformação só precisa ser executada uma vez que, após a qual fermento altamente eficiente aca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos as discussões pensativo com membros do laboratório Ju e laboratório de Zhong e o apoio financeiro de Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Referências
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