Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.
Global gebreken in RNA polymerase II transcriptie kunnen worden overzien door transcriptomic studies analyseren steady-state RNA. Inderdaad, de globale daling in mRNA-synthese is aangetoond te worden gecompenseerd door een gelijktijdige afname van de aantasting van het mRNA om te herstellen van de normale niveaus van de stationaire toestand. De genoom-brede kwantificering van mRNA-synthese, onafhankelijk van mRNA verval, is dus de beste directe reflectie van RNA polymerase II transcriptionele activiteit. Hier bespreken we een methode met behulp geen storing veroorzaakt metabole labeling van ontluikende RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In het bijzonder de cellen worden gekweekt voor 6 min met een uracil analoge 4-thiouracil en de gelabelde nieuw getranscribeerde RNAs worden gezuiverd en gekwantificeerd om te bepalen van de tarieven van de synthese van alle individuele mRNA. Bovendien, met behulp van label Schizosaccharomyces pombe cellen als interne standaard dit toelaat vergelijken van mRNA-synthese in verschillende S. cerevisiae stammen. Met behulp van dit protocol en de gegevens met een dynamisch kinetische model passend, kunnen de bijbehorende mRNA verval tarieven worden bepaald.
Cellen reageren op signalen van endogene en exogene, via de dynamische wijziging van hun gen expressie programma. In de afgelopen jaren kunt een enorme ontwikkeling van genoom-brede methodologieën de nauwkeurige en uitgebreide beschrijving van transcriptome wijzigingen in verschillende omstandigheden. In de meeste studies van de transcriptomic, microarray kruising of high-throughput sequencing worden gebruikt om RNA niveaus van een totale breuk van de stationaire toestand RNA te kwantificeren. Transcriptionele wijzigingen onder een specifieke perturbation kunnen een breed scala van mogelijke uitkomsten, met specifiek gen expressie veranderingen of een groot spectrum van genen up – of werden weergegeven. Genexpressie is het resultaat van een verfijnd evenwicht — of stationaire toestand — tussen RNA synthese van RNA polymerase en andere processen op het gebied van RNA niveaus. RNA polymerase II transcriptie, met inbegrip van haar drie verschillende fasen (initiatie, rek, en beëindiging), is zeer en ingewikkeld gekoppeld mRNA verwerking, cytoplasmatische export, vertaling en afbraak.
Verscheidene recente studies aangetoond dat mRNAs synthese en verval gekoppelde mechanismen en toonde dat transcriptionele effecten bij mutatie of onder prikkels worden over het hoofd gezien kunnen wanneer de totale steady-state RNA te kwantificeren. Ten eerste hangt de detectie van transcriptionele veranderingen door de analyses van de stationaire toestand niveaus van mRNA altijd mRNAs half-life. Zodra de verstoring wordt ingevoerd, zal de steady-state niveaus van mRNAs met lange halfwaardetijd veel minder dan die van mRNAs met korte halfwaardetijd worden beïnvloed. De detecteerbaarheid van de veranderingen in RNA-synthese is daarom sterk bevooroordeeld ten gunste van kortstondige afschriften, terwijl de analyse van langduriger mRNA soorten mislukken te onthullen van dynamische veranderingen in de transcriptie tarief. Ten tweede, verschillende rapporten is gebleken dat zowel in gist en zoogdieren, mondiale veranderingen in de transcriptie worden over het hoofd gezien kunnen bij het analyseren van de niveaus van de stationaire toestand van mRNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanismen die link mRNA-synthese en degradatie resulterend in mRNA bufferen. Dit leidde tot de ontwikkeling van nieuwe protocollen te kwantificeren van mRNA-synthese rekken van degradatie, door de analyse van nieuwe getranscribeerde mRNA. In de afgelopen jaren zijn diverse alternatieven ingediend, met inbegrip van mondiale run-on sequencing (GRO-seq)1en inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)2,3. Hier, presenteren we een protocol oorspronkelijk is ontwikkeld in zoogdiercellen4,5,6 en vervolgens aangepast aan gist7,8,9,10, 11, die is gebaseerd op RNA labelen met een thiolated nucleoside of base analoog, 4-thiouridine (4sU) of 4-thiouracil (4tU), respectievelijk.
Deze methode specifiek zuivert nieuw getranscribeerde RNA van cellen in welke RNA zijn pols-aangeduid met 4sU met vrijwel geen inmenging in de homeostase van de cel. Zodra de cellen worden blootgesteld aan 4sU, is het molecuul dus snel uptaken, phosphorylated aan 4sU-trifosfaat, en opgenomen in de RNAs wordt getranscribeerd. Als puls-label, is het mogelijk om uit te pakken van totale cellulaire RNA (overeenkomend met de steady-state niveaus van RNA) en vervolgens de 4sU-geëtiketteerden RNA breuk thiol-specifiek is gewijzigd, wat leidt tot de vorming van een Zwavelbrug tussen Biotine en de nieuw Getranscribeerd RNA4,5. 4sU kunnen echter alleen uptaken door de uiting van een nucleoside-vervoerder, zoals de menselijke equilibrative nucleoside vervoerder (hENT1), voorkomen van het directe gebruik ervan in de ontluikende of kernsplijting gist cellen. Terwijl men kon hENT1 S. pombe of S. cerevisiaeexpress, kan een eenvoudiger aanpak worden bereikt met behulp van de gewijzigde basis 4tU, aangezien de gistcellen kunnen duren van 4tU, zonder de behoefte aan expressie van een nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. In feite, het metabolisme van 4tU de activiteit van het enzym uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) vereist. In verschillende organismen, met inbegrip van gist maar niet zoogdieren, is UPRT essentieel voor een pyrimidine berging traject, uracil aan uridine monofosfaat recycling.
Een belangrijke vertekening in transcriptomic studies kan worden ingevoerd door de normalisatie tussen verschillende monsters geanalyseerd in parallel. Inderdaad, de vele afwijkende factoren kunnen invloed hebben op de vergelijkende analyse van de transcriptome van mutant en wild-type stammen: de efficiency van lysis van de cel, verschillen in de extractie en het herstel van RNA, en afwijkingen in de kalibratie van de scanner voor microarray analyse , onder anderen. Zoals hierboven besproken, kunnen dergelijke variaties vooral misleidend zijn als globale effecten op RNA polymerase II transcriptie worden verwacht. Een elegante betekenen voor het nauwkeurig vergelijken van mRNA synthese tarieven tussen de verschillende monsters werd ontworpen met behulp van de verte verwante kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe als een interne standaard. Daarvoor een vast aantal label S. pombe cellen wordt toegevoegd aan de S. cerevisiae monsters, wild-type of gemuteerde cellen, voorafgaand aan cellysis en RNA extractie10. Vervolgens worden zowel stationaire als nieuw samengestelde RNAs van S. pombe pt S. cerevisiae gekwantificeerd door RT-qPCR of via het gebruik van spaanders microarray of high-throughput sequencing10. Het combineren van deze gegevens met kinetische modellering, kan absolute van mRNA-synthese en verval in de ontluikende gist worden gemeten.
In het kader van dit manuscript, zullen we laten zien hoe de analyse van nieuwe getranscribeerde RNA toegestaan te onthullen van een mondiale rol voor de coactivator complexen SAGA en TFIID in RNA polymerase II transcriptie in ontluikende14,15gist, 16. Bovenal afgelopen studies gekwantificeerd steady-state mRNA niveaus in S. cerevisiae en gesuggereerd dat SAGA speelt een overheersende functie op een beperkt aantal gist genen die sterk beïnvloed door mutaties in SAGA, maar relatief resistent tegen TFIID mutaties17,18,19. Verrassend, werden de SAGA enzymatische activiteiten getoond om op te treden op het hele getranscribeerde genoom, suggereren een bredere rol voor deze co activator in RNA polymerase II transcriptie. Verminderde RNA polymerase II recruitment meest uitgedrukte genen werd waargenomen op de inactivering van SAGA of TFIID, suggereren dat deze coactivators samen op de meeste genen werken. Vandaar, de kwantificering van nieuw getranscribeerde mRNA geopenbaard dat SAGA en TFIID nodig voor de transcriptie van bijna alle genen door RNA polymerase II14,15,16 zijn. De toepassing van compenserende mechanismen komt naar voren als een manier voor de cellen om te gaan met een algemene afname van de mRNA-synthese die door een gelijktijdige wereldwijde afname van de aantasting van het mRNA is gebufferd. SAGA toegevoegd aan de lijst van factoren die een globaal effect op RNA polymerase II transcriptie, zoals RNA Pol II subeenheden10, de bemiddelaar coactivator complexe20, de algemene transcriptie factor TFIIH21,22 , en indirect, elementen van de mRNA afbraak machines9,10,23. Dergelijke compenserende evenementen werden universeel waargenomen in SAGA mutanten, administratieve verwerking van de bescheiden en beperkte veranderingen in stationaire toestand mRNA niveaus ondanks een globale en ernstige daling in mRNA synthese14. Soortgelijke analyses werden ook uitgevoerd in een BRE1 schrapping stam, wat resulteert in een volledig verlies van Histon H2B ubiquitination. Interessant is dat kon een veel mildere maar consistent globaal effect op RNA polymerase II transcriptie worden opgespoord in de afwezigheid van Bre1, die aangeeft dat metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA in gist kan detecteren en kwantificeren van een breed scala van veranderingen in mRNA synthese tarieven.
Terwijl genoom-brede tools om te analyseren van wijzigingen in de transcriptie nog steeds verbeteren zijn, kan de enige analyse van transcriptome door middel van de kwantificering van de stationaire toestand niveaus van RNA niet nauwkeurig overeen wijzigingen in RNA polymerase II activiteit. Inderdaad, mRNA niveaus worden geregeld, niet alleen door RNA-synthese, maar ook door hun rijping en afbraak. Voor het meten van mRNA-synthese rekken van mRNA afbraak, zijn verschillende protocollen ontwikkeld in de afgelopen jaren v…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Laszlo Tora voor zijn steun en V. Fisher, K. Schumacher en F. El Saafin voor hun discussies. T.B. werd gesteund door een Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) en de Fondation ARC. Dit werk werd gesteund door fondsen van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Deze studie werd ook ondersteund door ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door de Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d’Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.
4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |