Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Summary

우리 더 vivo에서 부분 간 미래에 엔지니어링을 공부에 대 한 전제 조건으로 쥐에서 vivo에서 단일 간 엽 관류 모델에 대 한 새로운 수술 기법을 설정 합니다.

Abstract

기관 공학 이식에 사용 될 수 있다 간 장기 대체를 생성 하는 새로운 전략 이다. 최근, vivo에서 간 엔지니어링, vivo에서 기관 decellularization repopulation 다음, 포함 떠오르고 있다 유망 접근 방식으로 비보 전 간 공학에. 그러나, 수술 후 생존 하지 달성 했다. 이 연구의 목적은 vivo에서 간 엔지니어링에 대 한 전제 조건으로 선택적 간 엽 관류 쥐에서 vivo에서 의 새로운 수술 기법을 개발 하는 것입니다. 우리는 왼쪽된 측면 엽 통해서만 회로 바이패스를 생성합니다. 다음, 왼쪽된 측면 엽은 heparinized 염 분을 끼얹는다. 실험 4 그룹으로 수행 됩니다 (n = 그룹 당 3 쥐) 20 분, 2 시간, 3 h, 그리고 4 헤 생존의 다른 관류 시간으로 색상의 거시적 보이는 변화와 혈액 세포의 조직학 결정된 부재에 따라는 포털 3 인조와 사인, 성공적인 모델 설립에 대 한 지표로 서 가져온 것입니다. 왼쪽된 측면 엽의 선택적 관류, 후 우리는 왼쪽된 측면 엽, 실제로, 아닙니다 빨강에서 희미 한 노란색을 관찰 합니다. 조직학 평가에서 아니 혈액 세포는 문맥, 중앙 정 맥, 그리고는 사인의 지점에 표시 됩니다. 왼쪽된 측면 엽 막힌된 혈관을 재개 후 빨간색으로 바뀝니다. 12/12 쥐 1 주일 이상에 대 한 절차를 살아 남았습니다. 우리는 1 주일 이상 긴 생존 기간 단일 간 엽 관류 비보에 대 한 수술 모델을 보고 처음. 이전 게시 된 보고서와 달리 여기에 제시 된 기법의 가장 중요 한 장점은 관류의 70%의 모든 절차를 통해 유지 됩니다. 이 기술은 설립 vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐, decellularization 및 recellularization를 포함 하 여 기초를 제공 합니다.

Introduction

장기 이식에 대 한 표시는 지속적으로 확장 하 고 있다. 반면, 장기 기부 속도 장기의 전반적인 품질은 감소, 이식에 대 한 수요 증가에 지도. 간 이식 대기자 명단에 추가 하는 후보자의 수 증가를 계속 (예를 들어, 미국에서 11,340 환자는 2016 년, 추가 된 10,636에에서 비해 2015)¹. 상당한 노력에도 불구 하 고 사용 가능한 기관의 수는 임상 요구를 충족 하지 않습니다. 때문에 간 질환의 발병 률 증가, 많은 환자는 기증자 기관 전에 이식 대기자 명단에 말기 간 질환 다 사용할 수 있습니다. 간 기증자 이식에 대 한 거 대 한 수요를 충족 하기 위해 간 조직 엔지니어링 원칙을 적극적으로 되는 사용 하 여 대체 방법을 추구². 요즘, 간 엔지니어링의 새로 개발된 된 생물 기술 잠재적으로이 부족을 극복할 수 있습니다.

간 엔지니어링 두 단계로 구성 됩니다: acellular 비 계, 발판의 repopulation 다음의 세대. 생물 학적 acellular 간 비 계를 얻으려면 explanted 간 끼얹는다 시스템을 통해 혈관에서 간 세포 물질을 제거할 수 있습니다 또는 비 이온 세제입니다. 대부분의 이전 연구에서 생물 acellular 간 비 계는 나트륨 라우릴 황산 염 및 TritonX100의 조합으로 간 관류에 의해 달성 되었다. 그 결과, 모든 셀 세포 외 매트릭스의 구조를 유지 하는 반면, 제거 되었다. 기관 건설 기계와 성숙한 세포, 간세포, 내 피 세포 선, 및 내 피 세포 또는 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 동시 응용 프로그램의 유무에 관계 없이 기본 hepatocytes 다시 시드해야 했다. 대부분의 연구원은 초점 비보 전 간 엔지니어링^{3,,45,6,7,8,9,10, 11,12,,1314}. 그러나, 대부분의 이전 연구에서 작은 조각의 다시 채울 발판 큐브 다른 heterotopic 이식 사이트에 이식 했다. 몇 가지 연구에서 다시 채울 부분 건설 기계 보조 이식으로 이식 했다. 그러나, 최대한 보고 생존에 72 h^8,14했다. 우리가 아는 repopulated 전체 간 이식의 orthotopic 이식은 아직 된 또는 수행에 대 한 게시. 장기 기능과 설계 기관의 이식 그들의 초기에서 여전히 있습니다. 따라서, 공학 비보 전 간 다른 접근은 필요 하다.

Vivo에서 간 공학 간 repopulation 생리 적 조건 하에서 공부 하는 대안을 나타낼 수 있습니다. Vivo에서 간 엔지니어링 비보 전 간 공학에 비해 장점은 매니폴드입니다. Vivo에서 다시 채울 부분 간 발판은 적절 한 온도, 충분 한 산소, 영양소, 및 관류 비보 전 인공 문화 매체와 달리 성장 요인 생리 혈액 관류를 받게 됩니다. 또한, 나머지 부분 정상 간 간장 기능, 주로 장기 생존을 수 있도록 유지 합니다. 이식 비보 전 설계 간 이식 실험 동물의 장기 생존을 유지 하는 그것의 간 기능⁸의 수 이므로, 우리는 vivo에서 부분 간 engineeringwould 궁극적으로 될 계획을 유망 모델 추가 비보 전보다 더 긴 생존 관찰과 조작된 간의 진화를 연구 하.

최근, 하나의 연구 그룹 (팬 및 동료) 제시, 처음으로, vivo에서 간¹⁵엔지니어링의 기술. 그들은 해부학 및 기술 문제에도 불구 하 고 살아있는 쥐에서 바로 열 등 한 간 엽의 절연된 관류 달성. 그들은의 repopulation vivo에서 쥐 주 hepatocyte 셀 라인을 사용 하 여 첫 번째 자가 결과 보고. 그러나, vivo에서 외과 관류 모델의 팬 외. 단점이 있습니다. 그들은 완전히 문맥 및 동물에 심각한 피해를 일으킬 수 있습니다 열 등 한 베 나 정 맥 차단 희생 쥐에서 단일 간 엽 관류 달성. 실험 쥐의 자가 관측 시간 6 시간만에 후 희생 했다. 따라서, vivo에서 간 엽 관류 기술을 더 개선 수술 후 생존을 달성 하기 위해 필요 합니다.

우리 쥐¹⁶, hemodynamic 쥐¹⁷, 및 간 바이오 모니터링을 위한 포털 정 맥 cannulation 기술 간 해부학의 이전의 연구에 따라 간 엽 관류, 비보에 대 한 새로운 생존 모델 개발 ^{18 , 19}. 절차에 대 한 주요 단계 그림 1A – 1E에 나와 있습니다.

이 기술은 기관 질환에 대 한 화학 절제로 약물 주입, vivo에서 decellularization에 의해 기본 연구 부분 장기 치료에 대 한이 실험 vivo에서 관류 모델을 사용 하 고 싶은 사람들을 위해 적당 하다 (예: , 간 암), 세포 배양의 비보 전 2 차원 및 3 차원 비교 decellularized 매트릭스 vivo에서 세포 문화 시스템^{20,21,,2223 , 24 , 25 , 26}, 그리고 vivo에서 decellularization와 repopulation 엔지니어링 간.

Protocol

주택 및 실시 하는 모든 절차는 독일 동물 복지 입법에 따라 했다. 모든 거 즈, 덮 음 옷, 그리고 수술 악기 압력가 마로 소독 하 고 수술을 하기 전에 준비 있습니다. 모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 1. 수술에 대 한 쥐의 준비 유도 챔버에 쥐를 놓고 쥐 완전히 마 취 때까지 약 3 분, 0.5 L/분 100% 산소와 4% 증발 isoflurane 쥐를 anesthetize. 유도 실에서 쥐를?…

Representative Results

12 남자 (세 12-13 주) 루이스 쥐 선택적 간 엽 관류의 효과 평가 하는 데 사용 했다. 실험 4 개의 그룹에서 수행 되었다 (n = 3 쥐 그룹 당). 20 분의 다른 관류 기간을 사용 하 여, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 위에서 설명한 단계를 따라 우리가 성공적으로 달성 단일 엽 관류 vivo에서 . Vivo에서 왼쪽된 …

Discussion

차단 하 고 cannulating 유체 유입으로 카 테 터와 함께 왼쪽된 문맥 및 유체 출구로 다른 카 테 테 르와 왼쪽된 측면 간 정 맥, 우리 성공적으로 생성 한 vivo에서 유체 바이패스 왼쪽된 측면 엽 내 나타내는 기술은 cannulation에 대 한 혈관의 작은 크기와 출혈 발생의 위험이 높은 매우 도전 이다, 비록 그것이 가능 합니다. 4 시간 긴 관류 기간을 겪고도 쥐 쥐가 수술을 견딜 수 보여주는 적어도 1 주…

Materials

Perfusion Pump
Perfusor VI	B. Braun, Melsungen
Catheter
Versatus-W  Catheter	Terumo	SR+DU2419PX	24G, 0.74×19mm
Versatus-W  Catheter	Terumo	SR+DU2225PX	22G, 0.9×25mm
micro surgical instrument
micro scissors	F·S·L	No. 14058-09
micro serrefine	F·S·L	No.18055-05
Micro clamps applicator	F·S·L	No. 18057-14
Straight micro forceps	F·S·L	No. 00632-11
Curved micro forceps	F·S·L	No. 00649-11
micro needle-holder	F·S·L	No. 12061-01
general surgical instruments
standard sissors	F·S·L
mosquito clamp	F·S·L
serrated forcep	F·S·L
teethed forcep	F·S·L
needle-holder	F·S·L
suture
4-0 prolene	ethicon
4-0 ETHICON*II	ethicon
6-0 silk	ethicon
11-0 polyamide	ethicon