Målet med denne artikel er at fremlægge en metode, der giver mulighed for en 3-dimensional rekonstruktion af cerebrovaskulær træet i mus efter mikro beregnet tomografi og fastlæggelsen af antallet af hele fartøjet segmenter, der kan bruges til at kvantificere cerebral vasospasme i murine modeller af subaraknoid blødning.
Subaraknoidal blødning (SAH) er en undertype af hæmoragisk apopleksi. Cerebral vasospasme, der opstår i kølvandet på den blødning er en vigtig faktor patient resultat og er derfor ofte taget som en undersøgelse slutpunkt. Dog i lille dyreforsøg på SAH er kvantificering af cerebral vasospasme en stor udfordring. Her, præsenteres en ex vivo metode der giver mulighed for kvantificering af mængder af hele fartøjet segmenter, som kan bruges som et objektivt mål for at kvantificere cerebral vasospasme. I et første skridt, er endovaskulære støbning af cerebral Vaskulaturen udføres ved hjælp af en røntgenfast casting agent. Derefter, imaging tværsnitsdata er erhvervet af mikro computertomografi. Det sidste trin omfatter 3-dimensionelle genopbygning af den virtuelle vaskulær træ, efterfulgt af en algoritme til at beregne center linjer og mængder af de valgte fartøj segmenter. Metoden, der resulterede i en meget præcis virtuel rekonstruktion af cerebrovaskulær træet vist ved en diameter-baseret sammenligning af anatomiske prøver med deres virtuelle rekonstruktioner. Sammenlignet med fartøjet diametre alene, fremhæve fartøjer diskenhederne forskellene mellem vasospastisk og ikke-vasospastisk fartøjer vist i en serie af SAH og sham-drives mus.
Aneurysmatic subaraknoid blødning (SAH), en undertype af hæmoragisk slagtilfælde, er en almindelig sygdom i neurointensive pleje enheder. Udover tidlig hjerneskade (EBI), som består af cerebrale skader forårsaget af hændelsen blødning, selv, en anden vigtig faktor patient resultatet er forsinket cerebral iskæmi (DCI), defineret ved klinisk forværring gennem nedsat cerebral perfusion eller cerebral infarkt ikke tilknyttet interventionel eller kirurgiske procedurer1,2,3. Vigtige mekanismer bidrager til DCI er vasospasms af store cerebral fartøjer på den ene side; på den anden side microcirculatory dysfunktion med vasospasme af microvessels og microthrombosis og iskæmi relateret til kortikale sprede depressioner spille en rolle (gennemgik i Madonald 20141). Derfor, diagnosticering af vasospasme af de store cerebrale fartøjer er afgørende i klinisk praksis og viser et vigtigt slutpunkt i mange kliniske og eksperimentelle undersøgelser.
Trods det faktum, at funktioner af vasospasme i murine SAH modeller ikke er direkte overføres til de menneskelige patient, murine modeller af SAH relaterede vasospasme har været voksende betydning i de sidste år. I disse modeller er SAH foranlediget af endovaskulære glødetrådens perforering4,5,6,7,8, transection af cisternal fartøjer9, eller indsprøjtning af blodet i CSF10 ,11,12. I modsætning til store animalske modeller af SAH, der traditionelt var designet til at studere vasospasme13, har murine modeller den store fordel, at mange Transgene mus stammer er tilgængelige. Dette gør dem en fremragende værktøj for at studere molekylære mekanismer fører til vasospasme og DCI. Bestemmelse af cerebral vasospasme i mus er imidlertid udfordrende. Dette skyldes, at i modsætning til store dyremodeller hvor vasospasme kan undersøges ved hjælp af kliniske Billeddannende teknikker, i vivo billeddannelse til at analysere cerebral vasospasme i mus ikke er endnu tilgængelige. Derfor bestemmes vasospasme sædvanligvis ved hjælp af enten histologiske afsnit10,11 eller mikroskopisk efter støbning af cerebral fartøjer7,9,12. Men disse teknikker har Ulempen, at fartøjet diametre er undersøgt på definerede punkter kun.
Baseret på en tidligere undersøgelse7, præsenterer dette manuskript en metode for mål og reproducerbare analyse af vasospasme i en murine SAH model. Metoden er baseret på perfusion og støbning af cerebral fartøjer, ex vivo mikro-CT scanning, digital genopbygning af træet fartøj, og efterfølgende evaluering af mængder af hele cerebral fartøjer.
Murine SAH modeller er et vigtigt redskab for SAH grundforskning. Cerebral vasospasme bruges ofte som et slutpunkt i eksperimentelle studier undersøger de mekanismer, der fører til DCI efter SAH9,11. Dog er kvantificering af cerebral vasospasme i mus eller andre små dyremodeller af SAH udfordrende. Almindeligt, kvantificeres vasospasme ved ex vivo bestemmelse af fartøjet diametre på defineret anatomisk point efter endovaskulære perfusion og støbning7,9,12 eller ved bestemmelse af omkredsen af definerede fartøjer på histologiske sektioner10,11. Disse metoder har dog nogle ulemper: vasospasme vurderes kun på definerede anatomiske punkter; vasospasme i nabolandet fartøj segmenter kan undslippe evaluering. Histologiske artefakter præsentere en anden kilde til fejl. Desuden kan evaluering være temmelig subjektiv, fordi den nøjagtige position, hvor fartøjet diameter måles bestemmes af investigator.
Målet var derfor at etablere en metode, der kvantificerer cerebral vasospasme ved beregning af fartøjet volumen af hele cerebral fartøj segmenter fra tværsnits billeddiagnostiske data7. Den vigtigste fordel af den volumetriske metode præsenteres her er hele fartøjet segmenter kan undersøges. Dette undgår behovet for definition af et punkt, hvor fartøjet diameter måles. En yderligere fordel af evalueringen af hele fartøjet segmenter er at det formodentlig præsenterer en mere objektiv parameter for at kvantificere vasospasme end bestemmelse af fartøjet diametre på definerede punkter hvor vasospasme mere proksimale eller distale fartøjets kan undslippe evaluering. Digital repræsentation af fartøjet diameter ved hjælp af en farvekode giver en intuitiv vurdering af graden af vasospasme. Derudover fører volumetriske vurdering til større forskelle mellem vasospastisk fartøjer i forhold til evaluering af fartøjet diametre som vist i de repræsentative resultater. Den virtuelle genopbygning opnået med metoden præsenteres her afspejler den vaskulære anatomi. Det fremgår af evalueringen af den repræsentative serie, i hvilken fartøjet diametre måles mikroskopisk og fra de digitale rekonstruktioner var lighed, gengivelse observationer af en tidligere undersøgelse7. Men trods dens fordele er yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, hvorvidt metoden præsenteres her er overlegen i forhold til konventionelle analysemetoder vasospasme.
En begrænsning af den metode, der præsenteres her er, at det giver mere tid i forhold til mikroskopisk analyse af støbt hjernen prøver eller histologiske analyse (mikro CT-scanning tid 90 minutter pr. hjerne prøve, databehandling 45 min pr. hjerne prøve). Derudover kan tilgængeligheden af mikro CT scannere begrænse dens anvendelse. Antallet af dyr undersøges her var tilstrækkelig til at godtgøre muligheden af den protokol, der er beskrevet i dette håndskrift. Men hvis protokollen bør anvendes i undersøgelser, behandling, dyret tal skulle være beregnet baseret på de forventede virkninger på fartøjer diskenhederne og diametre. En anden begrænsning af denne og andre undersøgelser, murine SAH modeller er, at vasospasme er fastsat ex vivo. Dette gør longitudinelle studier umuligt at undersøger baseline værdier før SAH induktion og vasospasme på forskellige tidspunkter. Selv om undersøgelser har vist, at det er muligt at skildre anatomi af de store intrakraniel fartøjer af mus i vivo bruger magnetisk resonans tomografi18, CT angiografi19eller digital subtraktion angiografi20, disse metoder, at vores viden, har endnu ikke anvendes til at analysere cerebral vasospasme i murine SAH modeller in vivo. Af note er digital genopbygningen af den cerebrale kar med efterfølgende volumetriske evaluering af cerebral vasospasme præsenteres her ikke begrænset til brug på ex vivo micro CT data. Hvis høj opløsning vaskulære cross Sektional hjernen imaging i mus skulle blive tilgængeligt i fremtiden, kan det bruges til at udføre en volumetrisk analyse af vasospasme i vivo.
The authors have nothing to disclose.
Dele af denne undersøgelse er en del af ph.d.-afhandling af T. Pantel, præsenteret for det medicinske fakultet af Johannes Gutenberg-universitetet i Mainz. Undersøgelsen blev støttet af Friedhelm frigør Stiftung og ved Stiftung Neurochirurgische Forschung (tilskud til A.N.).
Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |