O objetivo deste artigo é apresentar um método que permite uma reconstrução 3-dimensional da árvore vascular em ratos após micro computado tomografia computadorizada e determinação de volumes de segmentos de toda embarcação que podem ser usados para quantificar o vasoespasmo cerebral em modelos de murino de hemorragia subaracnoide.
Hemorragia subaracnoide (SAH) é um subtipo de AVC hemorrágico. Vasoespasmo cerebral que ocorre no rescaldo do sangramento é um importante fator de determinação do resultado do paciente e, portanto, é frequentemente tomado como um ponto de extremidade do estudo. No entanto, em estudos com animais pequenos no SAH, quantificação de vasoespasmo cerebral é um grande desafio. Aqui, um método ex vivo é apresentado que permite a quantificação de volumes de segmentos do navio inteiro, que podem ser usados como uma medida objetiva quantificar vasoespasmo cerebral. Em uma primeira etapa, fundição endovascular da vasculatura cerebral é executada usando um agente radiopaco. Então, dados de imagens transversais são adquiridos por micro computadorizada. A etapa final envolve a reconstrução 3-dimensional da árvore vascular virtual, seguida por um algoritmo para calcular os volumes dos segmentos vaso seleccionado e linhas de centro. O método resultou em uma reconstrução virtual altamente precisa da árvore cerebrovascular mostrada por uma comparação baseada no diâmetro de amostras anatômicas com suas reconstruções virtuais. Comparado com diâmetros de embarcação sozinhos, os volumes de navio destacam as diferenças entre vasos vasospástica e não-vasospástica, mostrados em uma série de SAH e ratos de operação.
Aneurysmatic hemorragia subaracnoide (SAH), um subtipo de AVC hemorrágico, é uma doença comum em unidades de neurointensive. Além de lesão cerebral precoce (EBI), que compreende o dano cerebral causado pelo sangramento evento em si, outro importante fator para determinar o resultado do paciente é retardada isquemia cerebral (DCI), definida pela clínica deterioração através de deficiência cerebral perfusão ou infarto cerebral não associado com procedimentos cirúrgicos ou intervencionista1,2,3. Mecanismos importantes contribuindo para DCI são vasoespasmos dos grandes vasos cerebrais, por um lado; por outro lado, a disfunção microcirculatory com vasoespasmo de microvessels e microtrombose e isquemia relacionada com depressões espalha corticais desempenham um papel (revisto em 2014 Madonald1). Portanto, o diagnóstico de vasoespasmo dos grandes vasos cerebrais é crucial na prática clínica e exibe um importante ponto de extremidade em muitos estudos clínicos e experimentais.
Apesar do fato de que as características de vasoespasmo em murino modelos SAH não são diretamente transferível para os modelos humanos pacientes, murino de SAH vasoespasmo relacionado foram de crescente importância nos últimos anos. Nestes modelos SAH é induzida pela endovascular filamento perfuração4,5,6,7,8, transecção de navios cisternal9, ou injeção de sangue para o CSF10 ,11,12. Em contraste com grandes modelos animais de SAH tradicionalmente concebidas para estudar vasoespasmo13, murino modelos têm a grande vantagem que várias cepas de ratos transgénicos estão disponíveis. Isso os torna uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos moleculares, levando ao vasoespasmo e DCI. No entanto, a determinação de vasoespasmo cerebral em ratos é um desafio. Isso ocorre porque, em contraste com grandes modelos animais nos quais vasoespasmo pode ser examinado usando técnicas da imagem latente clínicas, na vivo para analisar o vasoespasmo cerebral em ratos de imagem ainda não está disponível. Portanto, vasoespasmo é comumente determinado usando ou cortes histológicos de10,11 ou microscopicamente após fundição de vasos cerebrais7,9,12. No entanto, essas técnicas têm a desvantagem desse navio diâmetros são examinados em pontos definidos apenas.
Com base em um anterior de estudo7, este manuscrito apresenta um método objectivo e reprodutível análise de vasoespasmo em um modelo murino de SAH. O método é baseado em perfusão e fundição dos vasos cerebrais, digitalização de micro-CT ex vivo , reconstrução digital da árvore de navio e posterior avaliação dos volumes dos vasos cerebrais inteiras.
Os modelos SAH murino são uma ferramenta importante para a pesquisa básica de SAH. Vasoespasmo cerebral é frequentemente usado como um ponto de extremidade em estudos experimentais, investigando os mecanismos leva DCI depois SAH9,11. No entanto, a quantificação de vasoespasmo cerebral em ratos ou outros pequenos modelos animais de SAH é um desafio. Comumente, vasoespasmo é quantificado pela determinação ex vivo de diâmetros de navio em pontos anatômicos definidos após perfusão endovascular e fundição7,9,12 ou por determinação da circunferência da dos navios definidos na histológica das seções de10,11. No entanto, esses métodos têm algumas desvantagens: vasoespasmo é avaliado apenas em pontos anatômicos definidos; vasoespasmo dos vizinhos segmentos navio pode escapar a avaliação. Histológicos artefatos apresentam uma outra fonte de erros. Além disso, a avaliação pode ser um pouco subjetiva, porque a posição exata onde o diâmetro do vaso é medido é determinada pelo investigador.
O objetivo era, portanto, estabelecer um método que quantifica o vasoespasmo cerebral pelo cálculo do volume do navio dos segmentos de toda embarcação cerebral de seção transversal de dados de imagem7. A vantagem mais importante do método volumétrico apresentado aqui é que toda embarcação segmentos podem ser examinados. Isso evita a necessidade de definição de um ponto onde o diâmetro do vaso é medido. Uma vantagem adicional da avaliação dos segmentos de toda embarcação é presumivelmente apresentar um parâmetro mais objetivo para quantificar vasoespasmo que determinação de diâmetros de navio em pontos definidos onde vasoespasmo da embarcação mais proximal ou distal pode escapar avaliação. Representação digital de diâmetros de navio usando um código de cores permite uma estimativa intuitiva do grau de vasoespasmo. Além disso, a avaliação volumétrica leva a maiores diferenças entre navios vasospástica comparados a avaliação dos diâmetros de embarcação conforme os resultados representativos. A reconstrução virtual alcançada com o método aqui apresentado reflete a anatomia vascular com precisão. Isso é mostrado pela avaliação da série representativa, em que navio diâmetros medidos microscopicamente em partir as reconstruções digitais foram semelhantes, reproduzindo as observações de um anterior estudo7. No entanto, apesar de suas vantagens, mais estudos são necessários para avaliar se o método apresentado aqui é superior aos métodos convencionais de análise de vasoespasmo ou não.
Uma limitação do método apresentado aqui é que dá mais tempo em comparação com a análise microscópica das amostras de cérebro fundido ou análise histológica (micro CT varredura tempo 90 minutos por amostra do cérebro, processamento de dados 45 min por amostra do cérebro). Além disso, a disponibilidade de micro scanners CT pode limitar sua aplicação. O número de animais examinados aqui foi suficiente para demonstrar a viabilidade do protocolo descrito neste manuscrito. No entanto, se o protocolo deve ser usado em estudos de tratamento, animal números teria de ser calculadas com base nos efeitos esperados na embarcação volumes e diâmetros. Outra limitação deste e outros estudos usando os modelos SAH murino é que o vasoespasmo é determinado ex vivo. Isso torna impossível de estudos longitudinais que investigar valores basais antes da indução de SAH e vasoespasmo em pontos diferentes do tempo. Embora estudos têm demonstrado que é possível descrever a anatomia dos vasos grandes intracranianas de ratos na vivo usando ressonância magnética tomografia computadorizada18, de angiografia computadorizada19ou subtração digital angiografia20, esses métodos, a nosso conhecimento, ainda não ter sido usado para analisar vasoespasmo cerebral em murino SAH modelos in vivo. Digno de nota, a reconstrução digital da vasculatura cerebral com posterior avaliação volumétrica de vasoespasmo cerebral aqui apresentado não está limitada ao uso em ex vivo dados micro CT. Se a imagem latente vascular cerebral secional transversal de alta resolução em camundongos deve se tornar disponível no futuro, ele poderia ser usado para executar uma análise volumétrica do vasoespasmo na vivo.
The authors have nothing to disclose.
Partes deste estudo fazem parte da tese de doutorado de T. Pantel, apresentada à faculdade de medicina de Johannes Gutenberg-Universidade de Mainz. O estudo foi apoiado pelo Friedhelm libera Stiftung e a pesquisa de Neurochirurgische Stiftung (subsídios para A.N.).
Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |