Vi presenterer en protokoll for å måle oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring i Drosophila melanogaster larver og voksne hjerner. En metabolsk analysator benyttes med en tilpasset og optimert protokoll. Mikro-vev begrensninger ble er en kritisk komponent i denne protokollen utformet og laget spesielt for bruk i denne analysen.
Denne protokollen beskriver en metode for å måle metabolismen i Drosophila melanogaster larver og voksne hjerner. Kvantifisere stoffskiftet i hele organer gir en vev-nivå forståelse av energi utnyttelse som ikke kan fanges når du analyserer primære celler og linjer. Denne analysen er ex vivo, det gir målenheten fra en rekke spesialiserte celler som arbeider sammen for å utføre en funksjon i en vev og modeller nærmere i vivo orgel. Metabolsk omprogrammering har blitt observert i mange nevrologiske sykdommer, inkludert neoplasi og nevrodegenerative sykdommer. Denne protokollen ble utviklet for å hjelpe D. melanogaster samfunnet undersøkelse av metabolismen i nevrologisk sykdom modeller med en kommersielt tilgjengelig metabolske analysator. Måle metabolismen av hele hjernen i metabolske analysatoren er utfordrende på grunn av geometrien i hjernen. Denne analyzer krever prøver å holde seg på bunnen av en 96-brønns plate. Cellen vareprøver og vev slag kan følge overflaten av cellen platen eller utnytte spheroid plater, henholdsvis. Imidlertid hindrer sfærisk, tredimensjonal form av D. melanogaster hjernen vev fra å platen. Denne protokollen krever en spesielt utformet og produsert mikro-vev selvbeherskelse som omgår dette problemet ved å hindre enhver bevegelse av hjernen samtidig gir metabolske målinger fra de analyserer to SSD sensor sonder. Oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser er reproduserbare og følsom for behandling med metabolske hemmere. Med en mindre optimalisering, kan denne protokollen tilpasses for bruk med alle hele vev og/eller modellsystem, såfremt utvalgsstørrelsen ikke overstiger kammeret generert av tilbakeholdenhet. Mens basal metabolske målinger og en analyse etter en behandling med mitokondrie hemmere er beskrevet i denne protokollen, kunne utallige eksperimentelle forhold, som energi kilde preferanse og oppdrett miljø, bli avhørt.
Metabolsk omprogrammering har blitt identifisert i mange nevrologiske sykdommer, inkludert glioblastom Multiforme (GBM), Huntingtons sykdom og store depressiv lidelse (MDD)1,2,3. Som metabolismen blir fokus for strategier, har verktøy for grunnleggende metabolske forskning avanserte. De fleste av disse metodene ble designet linjer og primære celler eller analysere større vev etter fiksering eller -frysing. Noen metoder har stolt på kits simplistically måle bestemt metabolitter, mens andre har benyttet mer kostbart og komplisert analyser utnytte Ture i kombinasjon med massespektrometri4 for samme mål. For å forstå større metabolske landskapet, metabolske profilering5,6 og metabolske flux analyse (UD)7 dukket opp for å utfylle de store proteomic og genomisk studier. Profilering gir en kvantitativ representasjon av metabolitter i en celle eller vev på et tidspunkt i tid, mens MFA utvider på dette ved at sporing av merket metabolitter over tid. Sistnevnte har vært nyttig å avsløre hvordan energikilder benyttes annerledes i en celle eller vev i sykdom staten8. Disse metodene inkluderer imidlertid ikke måling av samlet metabolske rate.
For å avhøre samlede metabolsk delstaten lite systemene, kan tradisjonelle metoder, som Clark elektrode9 og indirekte calorimetry10, brukes til å måle oksygenforbruk eller konfigurert for Stopp flyt respirometry, til måle oksygen og karbondioksid konsentrasjon, henholdsvis. Disse teknikkene, har mens nøyaktig gir innsikt i avlesning av metabolske omprogrammering på organismen nivå, begrensninger. Bruk av Clark elektroden kan være teknisk utfordrende og er ikke utformet for høy gjennomstrømming studier. Stopp flyt respirometer kan ikke fungere med følsomhet må analysen eller vev. Flere år siden, utviklet ny teknologi spesielt for disse mindre programmer11. Disse instrumentene var opprinnelig ment å måle oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring av linjer og primære celler i 24 – eller 96-brønnen format. Enkelheten i oppsett og data output etablerte denne metoden som et alternativ til de tradisjonelle tilnærmingene. Denne metoden er et kraftig verktøy for celler nylige fremskritt har lov for måling av vev slag12,13,14. Metodene benyttet i disse analyser tillater imidlertid ikke for måling av hele organer fra små modellsystemer.
Metabolsk analyse av sykdom modeller innebærer ofte samspillet mellom cellene i spesialiserte funksjonen bosatt innenfor samme vev. For eksempel produsere gliacellene metabolitter benyttes av neurons. Disse metabolske interaksjoner kreves for neuronal overlevelse15. Lite systemer er fordelaktig for å undersøke spørsmål som disse. Studier for å måle metabolismen av et hele organ, som inneholder en rekke celletyper, legger til forståelsen av energi utnyttelse i vivo. Nylig, Becker et al. rapportert en metode for å måle oksygenforbruk i hele fly hoder16. Ved pooling flere hoder sammen i en brønn av en 24-vel celle plate, ble oksygen forbruk målinger innhentet ved hjelp av en metabolsk analysator. Mens dette fungerer godt for hoder, som er lett skilles fra kroppen, er det mye vanskeligere å bruke for organer som larver hjernen, fordi en stor mengde må være dissekert for denne metoden. Derfor ble metode bruker en 96-brønns celle plate, som øker følsomheten oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring opplesninger, utviklet for å analysen en enkelt hele larver hjerne.
Metabolsk analysatoren brukt i denne studien krever prøven måles for å være nederst på av en 96-brønns celle plate. For celler og relativt flat vev er dette ikke en utfordring; men for D. melanogaster larver og voksne hjernen er det ikke mulig å bruke tradisjonelle plate belegg protokoller. Sfærisk tredimensjonal form av hjernen vil ikke pålitelig overholder tallerken overflaten, og de som gjør er ofte skadet under forsøk på å plassere dem riktig i brønnen. En viktig del av denne nye protokollen er design og utvikling av mikro-vev begrensninger17 som gir et lite kammer for hjernen å ligge i uten å forstyrre metabolske målinger. Kammeret generert er rundt 0.016 i høyde og gir nok plass holder mange D. melanogaster hjernen. Baksetet består av nylon maske festet til en inert polymer ring og vil bli diskutert nærmere i Representant resultater. Med disse begrensninger reduserer tiden det tar å forberede dissekert hjerner metabolske målingen. Optimalisere måling fremgangsmåten genererer jevn, reproduserbare oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser etter seks målesykluser (av 25 min). Hjernen være metabolically aktiv under disse forholdene i minst 2 h, som gjør injeksjoner av therapeutics, hemmere, eller andre behandlinger via metabolske analyzer patron stoffet levering portene. Denne protokollen kan også være enkelt tilpasses til andre vev og lite systemer18.
Protokollen nedenfor beskriver hvordan du analysen oksygenforbruk i hele Drosophila larver hjernen når utfordret mitokondrie stress. Stress hjernen, legges oligomycin til hemme ATP syntase19. Nedgangen i oksygenforbruk fra basale målinger viser en måling av hvor mye ATP-avhengig av åndedrett i hjernen. Ytterligere nedgang i oksygen inntak etter behandlinger med rotenon20 og antimycin21, hemmere av elektronet transport kjeden komplekser I og III, henholdsvis angir mengden ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk i den hjernen. Denne analysen er et eksempel på hvordan mitokondrie åndedrett i et fly hjernen kan sammenlignes og hvordan denne protokollen kan brukes til å sammenligne metabolismen i ulike genotyper. Men kan denne protokollen tilpasses for å måle bare basale oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser, samt å utforme mer omfattende studier som undersøker spesifikke energi utnyttelse eller substrat utnyttelse hypoteser.
Her er en ny metode for metabolske analyse av D. melanogaster larver og voksne hjerner ex vivo beskrevet. Under basale forhold angi oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser hvordan metabolically aktiv hjernen er og kan avgjøre om en vev blitt mer avhengig mitokondrie versus glycolytic åndedrett, henholdsvis11.
Behandle hjernen med hemmere eller terapeutisk medisiner kan gi ytterligere informasjon om metabolske av vev. Metabolsk underlag kan også legges til å angi avhengigheter på bestemte metabolitter, som glukose å teste for Warburg effekt22 eller glutamin undersøke glutaminolysis23-både vanlig i metabolske omprogrammering. For langsiktige studier, larver eller fluer kan også bli matet narkotika i stedet for injeksjon porter, og hjernen kan være assayed med mellomrom eller på slutten-punktet, avhengig av eksperimentell design. Denne metoden kan optimaliseres for mange programmer.
Denne metoden er optimalisert for hjernen, men kan brukes til å analysere andre larver18 og voksen vev. I tillegg kan andre lite-systemer bruke denne metoden til å måle hele organismer18 eller vev. Den eneste begrensningen eller optimalisere denne metoden for andre systemer er størrelsen av orgel, vev eller organisme. Kammeret skapt av den mikro-vev tilbakeholdenhet er størrelse barriere å kjøre analysen. Hvis metabolske produksjonen er for lav for hjernen eller vev blir testet, og utvalgsstørrelsen er ikke en betingelse, kan pooling prøver brukes å øke analysen målinger og følsomhet. Å endre denne protokollen for andre programmer bør bare krever mindre optimaliseringer, inkludert 1) å velge det aktuelle tiltaket og bland syklus tall og timing og 2) bestemme effektiv behandling konsentrasjoner for vevet. Mål og miksing ganger ble fastsatt av overvåking oksygen konsentrasjon målt av metabolske analyseringen under hver syklus. Dette kan sees ved å velge O2 knappen Y2 aksen i oversiktsvinduet etter fullført. I løpet av hver syklus, bør det være en drop-in oksygen konsentrasjon reflekterer vevets oksygenopptak ved den målte tiden, etterfulgt av en tilbake til den opprinnelige oksygen konsentrasjonen under miksing syklus. Mål og bland tidene bør testes før dette mønsteret er observert. Bruker denne metoden, har andre insekt hjerner blitt studert. Disse hjernen var større enn fly hjernen brukt her, men fortsatt passer innenfor kammeret generert av vev tilbakeholdenhet. OCR målinger fra disse hjernen var så høyt som 400 pmol/min (data ikke vist). Resultatene fra disse studiene, samt OCR priser som samsvarer med andre studier måle hele-fly oksygen forbruk18,24, tyder på at D. melanogaster hjernen ikke var oksygen-begrenset. For både D. melanogaster hjernen og vev fra andre organismer krever bruk denne metoden spesiell oppmerksomhet til fire avgjørende skritt.
For å kunne oppnå reproduserbare og biologisk relevante målinger, er det kritisk trinn av protokollen som må følges. Først, bruk av en mikro-vev selvbeherskelse er obligatorisk for denne metoden. Produksjon disse begrensninger med spesifikasjoner og materialer som er nevnt er viktig. Materialet ble valgt inert kjemiske sammensetningen og deres evne til å tillate riktig exchange under miksing trinnene uten å skape luftbobler. Andre er en betimelig disseksjon og plate forberedelse nødvendig å maksimere metabolske produksjonen av vev. Kort disseksjon ganger bør ikke betydelig svekke hjernen. Andre studier har vist at fly hjerner kan holdes i live timer til dager etter disseksjon Hvis riktig lagret i en kammer25. Men som vist i figur 3B og 3D, hvis hjerner er venstre sitter i analysen media over lengre tid før analysen, er oksygen forbruk prisene redusert. Under analysen gjennomgå prøver en blanding trinn i løpet av hver syklus. Dette blande ikke bare hjelpemidler med injeksjoner av kjemiske forbindelser, men også handlinger for å recirculate media og skaffe oksygen. Hjernen kan bli metabolically aktiv i lengre perioder disse mål-blanding syklusene enn de ville være incubating inne media øverst benk. Derfor skal dissection larver hjerner beherskes før du begynner å sette opp denne analysen. Når konfigurere denne analysen, analysere en rekke genotyper samtidig, minimere antallet Hjerner nødvendig og brønner utnyttet. Dette vil hindre forsinkelser mellom den dissekere og analysen målinger. Tredje, opprettholde en stabil temperatur er nødvendig å analysere de metabolske prisene i fysiologisk relevante forhold. Økt analysen temperaturer kan føre til vev død, observert av lavere oksygen forbruk priser (Figur 3 c). Hvis fluer er reared i en annen temperatur for eksperimentelle formål, skal målingene også utføres ved denne temperaturen. Mens disseksjoner sannsynligvis blir utført ved romtemperatur, hvis analysen vil bli utført ved en annen temperatur, bør belagt og behersket hjernen være ruges på ønsket temperatur i 15 min før du kjører analysen. Endelig, observere brønner etter analysen er avgjørende for å avgjøre om vev plasserer påvirket målinger. Noen ganger vil det være en avvikende godt som, etter å observere platen under dissecting mikroskopet, kan elimineres fra dataanalyse på grunn av enten tap av vev eller mispositioning, der hjernen har glidd ut av sentrum av brønnen og stakk under polymer ringen av tilbakeholdenhet. Vev kan gå tapt hvis tilbakeholdenhet ikke ble sikret skikkelig til brønnen og ble forstyrret under blande sykluser. Mens ingen av disse hendelsene skjer ofte, hvis de ikke er ekskludert fra analysen, vil de redusere verdiene vesentlig.
Måling av hele-vev metabolske fluks av overvåking oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring inneholder en biologisk relevante metode for å forstå hvordan metabolisme er endret av genetisk landskapet eller andre eksperimentelle forhold. Denne metoden er følsom nok å oppdage metabolske forandringer i en enkelt D. melanogaster hjernen, som ikke er mulig å bruke stop-flow respirometry eller indirekte calorimetry. Det er også mindre teknisk utfordrende enn å bruke en Clark elektrode for å måle oksygenforbruk. En ekstra fordel av denne protokollen er muligheten til å analysere en hel hjernen per brønn. 96-brønns formatet tillater mer følsomme opplesninger, og dermed flere genotype kan være assayed samtidig på grunn av mindre antall prøver må etter analysen. Mens måle stoffskiftet i vev er fortsatt utfordrende og krever nøye oppdratt og synkronisert dyr, denne protokollen beskriver en metode for rask, relativt enkle, og har potensial til å analysere mange metabolske følsomhet i D. melanogaster larver og voksne hjerner.
The authors have nothing to disclose.
Aksjer fra Bloomington Drosophila lager Center (NIH P40OD018637) ble brukt i denne studien. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av institusjonelle Development Award (idé) nettverk for biomedisinsk forskning Excellence fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under bevilgning nummer P20GM103430, og av Rhode Island Foundation. Forfatterne takker J. vann og P. Snodgrass-beltet om deres støtte i utvikling av denne protokollen.
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |