本文提出了一种测定果蝇幼虫和成年脑中氧耗量和细胞外酸化的方法。代谢分析仪是利用一个适应和优化的协议。微组织约束是本协议的重要组成部分, 专门为其在分析中的应用而设计和创建。
本协议描述了一种测定果蝇幼虫和成年脑中代谢的方法。量化整个器官的新陈代谢提供了组织层面的理解, 能量利用, 不能捕获时, 分析主要细胞和细胞线。虽然这一分析是在体内, 它允许从一些专门的细胞的测量, 共同发挥作用, 在一个组织和更密切的模型的体内器官。代谢重新编程已经观察到许多神经系统疾病, 包括肿瘤和神经退行性疾病。本议定书的制定是为了帮助黑腹人社区对神经疾病模型中代谢的调查使用一个商业上可用的代谢分析仪。在代谢分析仪中测量整个大脑的新陈代谢是很有挑战性的, 因为大脑的几何形状。这个分析仪要求样品保持在96井板的底部。细胞标本和组织冲孔可分别附着在细胞板表面或利用球形板。然而, 球形的, 三维的形状的D.该协议需要一个专门设计和制造的微组织克制, 绕过这个问题, 防止任何运动的大脑, 而仍然允许代谢测量的两个固态传感器探头。氧消耗和胞外酸化率对代谢抑制剂的治疗具有重现性和敏感性。通过一个小的优化, 这个协议可以适应使用任何整个组织和/或模型系统, 只要样本大小不超过由约束产生的会议厅。在本议定书中描述了线粒体抑制剂治疗后的基础代谢测量和分析后, 可以对无数的实验条件, 如能量源偏爱和饲养环境进行审问。
代谢重新编程已经确定在许多神经系统疾病, 包括胶质瘤多形性 (肾小球), 亨廷顿的疾病, 和主要的抑郁症 (MDD)1,2,3。随着新陈代谢成为治疗策略的焦点, 基本代谢研究的工具也在不断进步。然而, 这些方法大多是为了研究细胞系和主细胞, 或分析后固定或冷冻的较大组织。一些方法依赖于简单测量特定代谢物的试剂盒, 而另一些则使用了更昂贵和复杂的分析, 利用色谱与质谱4相结合的目标。为了了解更大的新陈代谢环境, 代谢分析5,6和代谢通量分析 (MFA)7出现补充了大规模蛋白质组学和遗传学研究。分析提供了在一个时间点的细胞或组织中的代谢物的定量表示, 而 MFA 扩大后, 允许跟踪标记代谢物随着时间的推移。后者有助于揭示当疾病状态8时, 细胞或组织中的能量源是如何被不同地利用的。然而, 这些方法并不包括对整体新陈代谢率的测量。
为了询问小模型系统的整体新陈代谢状况, 传统的方法, 如克拉克电极9和间接量热法10, 可用于测量耗氧量或配置为停止流 respirometry, 以分别测量氧和二氧化碳浓度。这些技术, 虽然准确地提供洞察到新陈代谢重新编程在有机体水平上, 有限制。克拉克电极的使用在技术上是有挑战性的, 不是为高通量研究而设计的。停止流呼吸不能与检测细胞或组织所需的灵敏度作用。几年前, 新的技术是专门为这些较小的应用开发的11。这些仪器最初设计用于测量24或96井格式的细胞系和主细胞的耗氧量和胞外酸化。设置和数据输出的简单性建立了这种方法作为传统方法的替代。这种方法是细胞的有力工具, 最近的进展已经允许测量组织拳12,13,14。然而, 这些化验所使用的方法不允许从小模型系统中测量整个器官。
疾病模型的代谢分析往往涉及在同一组织内的专门功能细胞之间的相互作用。例如, 胶质细胞产生神经元所使用的代谢产物。这些代谢相互作用是需要的神经元生存15。小型模型系统有利于调查这些问题。研究测量整个器官的新陈代谢, 包含各种细胞类型, 将增加对体内能量利用的理解。最近, 贝克等人报告了一种测量全飞头16的耗氧量的方法。通过将多个头聚集在一个24井细胞板的一个井中, 使用代谢分析仪获得氧消耗读数。虽然这是很好的头部, 这是很容易与身体分离, 它是更难以使用的器官, 如幼虫大脑, 因为需要解剖大量的这种方法。因此, 利用96井细胞板的方法, 提高了氧耗量和胞外酸化读数的灵敏度, 研制出一种单一的全幼虫脑。
本研究中使用的代谢分析仪要求测量的样品保持在96井细胞板井的底部。对于细胞和相对扁平的组织来说, 这不是一个挑战;然而, 对于果蝇幼虫和成年脑, 这是不可能使用传统的板涂层协议。球形的三维形状的大脑将不可靠地坚持板表面, 和那些做的往往是破坏, 而试图把他们正确地在井中。这一新的协议的一个关键部分是设计和发展的微组织限制17 , 提供一个小室的大脑驻留在不干扰代谢测量。所产生的室在高度约 0.016, 并提供足够的空间, 轻松地容纳许多D.黑腹脑。这些限制包括尼龙网附着在一个惰性聚合物环, 并将进一步讨论的代表性结果。使用这些限制可以减少为新陈代谢测量准备解剖大脑所需的时间。在六测量周期 (25 分钟) 后, 优化测量过程产生稳定、可再生的耗氧量和胞外酸化率。大脑保持新陈代谢活跃在这些条件下至少2小时, 这使得注射治疗, 抑制剂, 或其他治疗通过代谢分析仪墨盒药物传递端口。该协议也可以很容易地适应其他组织和小模型系统18。
下面详细说明了如何在对线粒体应激的挑战下, 测定整个果蝇幼虫脑中的氧耗量。为了强调大脑, 寡霉素增加了抑制 ATP 合成酶19。从基底读数中摄取的氧量的减少, 显示了在大脑中 ATP 依赖的呼吸量的测量。在治疗后的耗氧量进一步下降, 鱼藤酮20和 antimycin21, 电子转运链复合物 I 和 III 抑制剂, 分别表明, 非线粒体氧消耗量在大脑。这是一个例子, 说明如何比较的大脑线粒体呼吸, 以及如何使用这个协议来比较不同基因型的新陈代谢。然而, 这个协议可以适应简单地测量基本的氧气消耗量和细胞外酸化率, 并且设计更加详细的研究调查具体能量利用或基体利用假说。
本文介绍了一种新的对黑腹仔幼虫和成年脑前体代谢分析的方法。在基本条件下, 氧气消耗和细胞外酸化率表明大脑的新陈代谢是如何的, 并且可以确定组织是否越来越依赖于线粒体与酵呼吸的关系,分别为11。
用抑制剂或治疗药物治疗大脑可以提供关于组织代谢状况的进一步信息。还可以添加代谢基质, 以确定特定代谢物的依赖性, 如葡萄糖, 以测试华宝效应22或谷氨酰胺, 以调查 glutaminolysis23-两种常见的代谢重新编程。对于长期研究, 幼虫或苍蝇也可以喂食药物, 而不是使用注射端口, 大脑可以根据实验设计的时间间隔或终点进行测定。此方法可针对许多应用程序进行优化。
这种方法已被优化的大脑, 但可以用来分析其他幼虫18和成人组织。此外, 其他小模型系统可以利用这种方法来测量整个有机体18或组织。为其他系统优化此方法的唯一限制是器官、组织或有机体的大小。由微组织约束产生的腔体是运行该检测的大小障碍。如果新陈代谢的产出太低, 对大脑或组织进行测试, 而样本大小不是一个约束, 汇集样本可以用来增加化验测量和灵敏度。为其他应用程序修改此协议只需要进行少量优化, 包括 1), 选择适当的测量和混合周期数和时间, 2) 确定组织的有效治疗浓度。测定和混合时间由代谢分析仪在每个周期中测量的氧浓度确定。在运行完成后, 可以通过在 “概览” 窗口中的 “Y2 坐标轴” 按钮中选择O2来查看此项。在每个周期, 应该有一个下降的氧气浓度反映组织的氧气消耗在测量时间, 然后返回到初始氧浓度在混合周期。测量和混合时间应经过测试, 直到观察到这种模式。利用该方法对其他昆虫脑进行了研究。这些大脑比这里使用的苍蝇大脑大, 但仍然适合组织克制产生的腔内。这些大脑的 OCR 读数高达 400 pmol/分钟 (未显示数据)。这些研究的结果以及与测量全飞氧消耗1824的其他研究相配合的 OCR 率表明, 黑腹的大脑没有氧的限制。对于其他生物体的脑和组织, 应用这种方法需要特别注意四关键步骤。
为了成功地实现可重复和生物相关的测量, 必须遵循议定书的关键步骤。首先, 这种方法需要使用微组织约束。使用所列规格和材料制造这些限制是必不可少的。这些材料的选择是由于其惰性化学成分, 以及它们在混合步骤中允许适当的介质交换而不产生气泡的能力。其次, 需要及时进行解剖和板材制备, 以最大限度地提高组织的代谢产物。短的解剖时间不应显著损害大脑。其他研究表明, 如果适当地储存在25的灌注室中, 飞行大脑可以在解剖后数小时内保持存活。然而, 如图 3B和3D所示, 如果在化验前长时间在检测介质中留下大脑, 那么氧气消耗率就会降低。在试验过程中, 样品在每个周期中都经过混合步骤。这种混合不仅有助于化学物质的注入, 而且还能超量介质和提供氧气。在这些测量混合周期中, 大脑能够保持新陈代谢活跃一段时间, 而不是在工作台顶部的介质中孵化。因此, 在开始建立这种检测之前, 应该掌握幼虫大脑的解剖。在建立这种检测方法时, 一次分析少量的基因型, 以尽量减少大脑所需的数量和使用的水井。这将防止解剖和化验测量之间的延迟。第三, 需要保持稳定的温度, 以分析生理相关条件下的新陈代谢率。增加的化验温度可能导致组织死亡, 观察到低氧消耗率 (图 3C)。如果在不同的温度下为实验目的饲养苍蝇, 测量也应该在这个温度下进行。虽然解剖最有可能在室温下进行, 如果化验将在不同的温度下进行, 则在运行该化验之前, 应在所需的温度下孵化被镀和克制的大脑15分钟。最后, 观察井后检测是确定组织定位是否影响测量的关键。偶尔, 会有一个异常好, 在观察板下的解剖显微镜下, 可以从数据分析中消除由于任何组织或 mispositioning 的损失, 大脑已经从井的中心滑出, 并卡住在聚合物环的约束下。如果不适当地将约束固定在井上, 并且在混合周期中受到干扰, 组织可能会丢失。虽然这些事件都不经常发生, 如果不排除在分析之外, 它们将大大降低速率值。
通过监测氧耗和胞外酸化来测量全组织代谢通量, 提供了一种生物学上相关的方法来了解新陈代谢是如何被遗传景观或其他实验条件改变的。这种方法很敏感, 可以检测到单脑的代谢变化, 这是不可能使用停止流 respirometry 或间接量热。与使用克拉克电极测量氧气消耗相比, 它在技术上也没有挑战性。这个协议的另一个优点是能够分析一个整体大脑每一个井。96井格式允许更敏感的读数, 因此, 一个以上的基因型可以检测的时间, 因为样本数量较少的每一次化验。虽然测量组织中的新陈代谢仍然具有挑战性, 需要精心饲养和同步的动物, 这个协议描述了一个快速的, 相对简单的方法, 并有可能分析许多代谢敏感性D。黑腹幼虫和成年脑。
The authors have nothing to disclose.
本研究采用了从布卢明顿果蝇库存中心 (NIH P40OD018637) 获得的股票。这份出版物中所报告的研究得到了国家卫生研究院国家医学研究所优秀生物医学研究机构发展奖 (理念) 网络的支持, 并获得赠款编号。P20GM103430 和罗德岛基金会。作者感谢 j. 水域和 p. 斯诺德格拉斯带在制定本议定书方面的支持。
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |