Caenorhabditis Si: En Low-tech Instrument og metode til sortering af små flercellede organismer
Summary
Den nuværende protokol omfatter en metode til sortering og rensning af alder-matchede populationer af Caenorhabditis elegans. Det bruger en enkel, billig, og effektiv skræddersyet værktøj til at opnå en stor eksperimentelle population af nematoder til forskning.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en veletableret model organisme, der anvendes på tværs af en vifte af grundlæggende og biomedicinsk forskning. Fællesskabets ødelægge forskning er der behov for en overkommelig og effektiv måde at opretholde store, alder-matchede bestande af C. elegans. Her præsenterer vi en metode for mekanisk sortering og rensning C. elegans. Vores mål er at levere en omkostningseffektiv, effektiv, hurtig og enkel proces for at få dyr af ensartet størrelse og udviklingstrin for deres anvendelse til forsøg. Dette værktøj, Caenorhabditis si, bruger et specialbygget låg system tråde på fælles konisk lab rør og sorterer C. elegans baseret på kropsstørrelse. Vi viser også, at Caenorhabditis si effektivt overfører dyr fra én kultur plade til en anden giver mulighed for en hurtig sortering, synkronisering og rengøring uden at det påvirker markører for sundhed, herunder motilitet og stress-inducerbar gen journalister. Dette tilgængelige og innovative værktøj er en hurtig, effektiv og ikke-stressende mulighed for at opretholde C. elegans populationer.
Introduction
Ormen nematodeprøveudtagning, Caenorhabditis elegans, er en førende model organisme. Ud over den enkle og kontrolleret karakter af deres dyrkning i laboratoriet, deres hele genom er sekventeret1 og udviklingsmæssige skæbne af hver celle er kendt for2. På grund af disse funktioner er C. elegans en meget anvendt model organisme til genetiske undersøgelser. Men sammen med disse gavnlige egenskaber kommer nogle udfordringer for forskere. På grund af deres hurtig generationstid, C. elegans befolkninger kan hurtigt løbe tør for mad og/eller blive blandet populationer med flere generationer og udviklingsstadier præsenterer på én gang. Forsøg udført på solid ødelægge vækst medier (NGM) kræver således, forskere fysisk flytte dyrene til frisk plader før den bakterielle fødekilde udtømning og udvikling af nye larver. Dette kan være trættende, som en hyppige overførsel af dyrene er påkrævet for at forhindre de eksperimentelle befolkninger fra at blive blandet med afkom generationer. Stadig, nogle eksperimenter kræver begge stort antal dyr og udvidet tidspunkter (fx, DNA eller RNA udvinding i voksenalderen). Dette forbindelser udfordringer med præcist opretholde en synkroniseret befolkning og overføre store mængder af dyr.
Nuværende metoder til at overføre C. elegans kulturperler på NGM picking eller vaske dyrene fra plade til plade; kemisk behandling af dyr (f.eks.med DNA replikation hæmmer fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller ved hjælp af flowcytometri for at sortere dyrene i multi godt plader. Picking indebærer anvendelse af en håndværktøj, lavet med enten en tynd platin tråd eller en øjenvipper, manuelt overføre enkelte eller flere dyr3,4. Denne metode er nøjagtig, men kræver både dygtighed og tid og er en begrænsning for undersøgelser, hvor stort antal dyr. Picking maj også være fysisk skade og stressende at dyrene af potentielt udsætte individer for unaturlige og inkonsekvent beløb forstyrrelse og kraft. Vask indebærer skylning en kultur parabol med en stødpudeopløsning og overføre løsning med dyr via glas Pasteur pipette til en ny kultur plade. Denne metode er hurtig og effektiv, men er ikke nøjagtig som flere generationer og udviklingsstadier af dyr overføres i bulk. Kemiske behandlinger, såsom FUDR, kan opløses i dyrkningsbaserede medierne til at forhindre produktion af afkom via blokering nogen DNA-replikation, og dermed gameter produktion og æg udvikling. Mens effektivt, denne metode skal anvendes efter udviklingsmæssige modning, ikke forstyrre de normale udviklingsprocesser, og det betyder, at der stadig et krav om at overføre dyr før sin administration3. Denne metode påvirker også flere cellulær signalering veje, hvilket resulterer i mærkbar indvirkning på dyr, som de bliver ældre (f.eks, en forlængelse af levetiden eller en ændret proteostasis) alt efter stamme af C. elegans brugt5, 6,7,8,9,10. Flow flowcytometri metoder automatisk sortere og overføre enkelte C. elegans fra en multi godt plade til en anden11. Mens denne metode er meget effektiv og produktiv, er flow flowcytometri udstyr uoverkommeligt dyre og utilgængelige for mange forskere. Et alternativ til overførsel af dyr er at bruge mutant modeller, der er temperaturen følsomme, som fer-15 og Five-1, som bliver steril med temperatur tilpasning12. Mens du bruger mutant dyr er nyttige i nogle situationer, disse specifikke stammer vokse langsommere end wild-type dyr og de er afhængige af en ændret genom, der tjener som fattige repræsentanter for aging eller sund orme. Derudover afhængigheden af en temperatur Skift til at fremkalde sterilitet resulterer også i mangel af en statisk miljø, og temperaturændringer har let vist sig at påvirke gen udtryk13,14, 15. forskergrupper har tidligere udgivet teknikker der beskriver brugen af en maske til at filtrere C. elegans af størrelse16. Men vi var afskåret fra hitte foregående arbejde testning for eventuelle ændringer i de samlede sundhedsresultater, der kan være forbundet med anvendelsen af sådanne filtre.
Der er således behov inden for forskningsverdenen C. elegans for en overkommelig, effektiv, hurtig og præcis metode til at overføre store mængder af dyr mellem kultur plader. Vi har udviklet en forbedret, tilgængelige stykke udstyr (opkaldt Caenorhabditis SI) og en tilknyttet protokol til dens fremstilling og drift, der opfylder behovene, som forskersamfundet C. elegans . Heri, vi dele design af Caenorhabditis si og metoder for dets anvendelse, og vi viser, at dets anvendelse ikke påvirker den almindelige sundhed eller nogen stress markører i forhold til standard manuel plukning og en behandling med de almindeligt anvendt, Fertility-begrænse kemiske FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi indført heri, design og brug af de tilgængelige, effektive Caenorhabditis si som et redskab for sortering og vedligeholde C. elegans. Dette værktøj har flere fordele til manuelt plukke enkelte dyr, vask populationer, kemiske behandlinger (f.eks.FUDR) og dyrere metoder til adskillelse dyr. Første, Caenorhabditis sigtes effektivt og hurtigt (mindre end 20 min) sorterer afkom fra store blandede bestande af dyr (tabel 2). Også brugen af værktøjet har ingen påvi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Heather Currey for hendes første bidrag til undersøgelsen design og Dr. Swarup Mitra for hans kritiske gennemgang af håndskriftet. Vi vil også gerne takke Dr. Michael B. Harris for kommentarer, justeringer og bistand i producerer demonstration af denne metode. Stammer, der var fastsat af Caenorhabditis genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Den forskning, der er rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute Of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award numre UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 og af en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer 5P20GM103395-15. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. UA er AA/EO arbejdsgiver og uddannelsesinstitution og forbyder ulovlig forskelsbehandling af enhver person: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
Referências
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genética. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genética. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
